結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA XIST、miR-32-5p、EZH2的表達(dá)變化及臨床意義

李文強(qiáng)，李?lèi)?ài)杰，張?jiān)疲澜鸩?/p>

1 濰坊醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院，山東濰坊261053；2 山東省腫瘤醫(yī)院

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，世界每年發(fā)病患者例數(shù)約110萬(wàn)，我國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率不斷升高，并且有年輕化的趨勢(shì)［1-2］。目前結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制還未闡明，可能與遺傳因素、飲食結(jié)構(gòu)、經(jīng)濟(jì)狀況等有關(guān)。因此，探究結(jié)腸癌的致病因素對(duì)疾病預(yù)防及早期篩查意義重大。非編碼RNA 是無(wú)蛋白編碼功能的RNA 分子，近年來(lái)研究表明，其在調(diào)控基因表達(dá)、染色質(zhì)重構(gòu)等過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，與炎癥、免疫及癌變的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［3］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（ln?cRNA）X 染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄本基因（XIST），位于Xq13.2，該基因是X 染色體上失活中心區(qū)域中第一個(gè)鑒定出的非編碼基因，對(duì)X 染色體失活的啟動(dòng)和維持至關(guān)重要。研究表明，lncRNA XIST 在多種腫瘤中異常表達(dá)，并影響腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為［4-5］。微小 RNA（miR）-32-5p 位于9q31.3，可調(diào)控多條細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，其作為一種抑癌基因，在非小細(xì)胞肺癌［6］、口腔鱗癌［7］等惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。基因增強(qiáng)子的人類(lèi)同源基因（EZH2）位于7q36.1，該基因編碼蛋白是多梳蛋白PcG 家族成員之一，具有多梳抑制復(fù)合物2（PRC2）的催化亞基，參與維持基因表達(dá)的調(diào)控，在細(xì)胞分裂增殖、染色體重構(gòu)及腫瘤發(fā)生等生理病理過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用［8］。有學(xué)者在結(jié)直腸癌HCT-8 腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，lncRNA XIST 通過(guò)抑制miR-32-5p 的表達(dá)，促進(jìn)EZH2 的表達(dá)，促進(jìn)HCT-8細(xì)胞的增殖及遷移等惡性生物學(xué)行為［9］。本研究觀察了結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA XIST、miR-32-5p 及EZH2的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集 2018 年 8 月—2019 年 8 月于山東省腫瘤醫(yī)院診治的86 例結(jié)腸癌患者的臨床病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均經(jīng)組織病理學(xué)檢查明確；患者均為首次診治，無(wú)放化療治療史；住院期間相關(guān)檢查及病理資料完整，患者已簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴腸道急慢性感染性疾病；既往罹患惡性腫瘤病史；伴心肺肝腎功能障礙。結(jié)腸癌患者中男51例，女35例；年齡27～78（52.4 ± 7.1）歲；腫瘤位置：直腸31 例，結(jié)腸55 例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 66 例；腫瘤直徑：≤3 cm 者 60 例，>3 cm 者 26例；腫瘤分期：Ⅰ期 23 例，Ⅱ期 33 例，Ⅲ期 24 例，Ⅳ期6 例；腫瘤分化程度：高分化26 例，中分化28 例，低分化32例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 組織中 lncRNA XIST、miR-32-5p 及 EZH2 檢測(cè) 各取癌組織及癌旁組織（距離癌組織5 cm 以上）約50 mg，剪碎后研缽中加液氮研磨，加入1 mL TRIzol 后重懸，利用TRIzol 法提取癌組織及癌旁正常組織中的RNA。將獲取的RNA 產(chǎn)物按照試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分光光度計(jì)檢測(cè)cDNA 濃度及 純度 ，cDNA 的 OD260/OD280在 1.8～2.1。 lncRNA XIST 正向引物序列：5"-TTGGGGAACCACCTA?CACTTGAG-3"，反向引物序列：5"-CCATTTTGCTAT?GCGTTATCTGA-3"；EZH2 正向引物序列：5"-CCCT?GACCTCTGTCTTACTTGTGGA-3"，反向引物序列：5′-ACGTCAGATGGTGCCAGCAATA-3′；內(nèi)參基因GAPDH 正向引物序列：5"-ACAGCCTCAAGATCAT?CAGC-3"，反向引物序列：5"-GGTCATGAGTCCTTC?CACGAT-3"；miR-32-5p 上游引物序列：5"-ACACTC?CAGCTGGGTACAGTATAGATGATGTACT-3"，下 游引物序列：5"-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3"；內(nèi)參基因U6 上游引物序列：5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"，下游引物序列：5"-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。總反應(yīng)體系20 μL，其中Master Mix 10 μL，上游及下游引物各1 μL，模板cDNA 1 μL，RNA-free 水8μL。LncRNA XIST 及 EZH2 反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 20 s，共40 個(gè)循環(huán)。miR-32-5p 反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共 50 個(gè)循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 lncRNA XIST、miR-32-5p及EZH2的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用-x±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；各指標(biāo)相關(guān)性用Pearson 線性相關(guān)進(jìn)行分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌與癌旁組織中l(wèi)ncRNA XIST、miR-32-5p及 EZH2 表達(dá)比較 lncRNA XIST、miR-32-5p 及EZH2 在結(jié)腸癌組織中相對(duì)表達(dá)量分別為2.172 ±0.243、0.544 ± 0.085、1.283 ± 0.212，在癌旁組織中分別為 1.079 ± 0.084、1.651 ± 0.122、0.479 ±0.110，癌組織中 lncRNA XIST、EZH2 相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織（t=39.423、31.218，P均<0.01），miR-32-5p低于癌旁組織（t=69.042，P<0.01）。

2.2 結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA XIST、miR-32-5p 及EZH2 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 癌組織中l(wèi)ncRNA XIST、miR-32-5p 及 EZH2 表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)（P均<0.05），見(jiàn)表1。

2.3 結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA XIST、miR-32-5p 及EZH2 表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA XIST與 miR-32-5p 呈負(fù)相關(guān)（r=–0.612，P<0.01），miR-32-5p 的相對(duì)表達(dá)量與EZH2 的相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r=–0.608，P<0.01），而lncRNA XIST與EZH2的相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯相關(guān)性（r=0.375，P=0.284）。

3 討論

結(jié)腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率在惡性腫瘤中排第三［10］。結(jié)腸癌的治療包括手術(shù)治療、放化療及生物靶向治療等。早期患者首選手術(shù)治療，但晚期轉(zhuǎn)移患者即使經(jīng)積極綜合治療仍預(yù)后不佳。因此，需深入研究結(jié)腸癌的病因及發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷治療靶點(diǎn)［11］。結(jié)腸癌的發(fā)病與遺傳因素、環(huán)境因素、飲食因素及腸道疾病等有關(guān)，各種因素綜合作用，促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞中癌基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，ln?cRNA、miRNA 等在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，其可通過(guò)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等機(jī)制調(diào)控下游癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移、抑制凋亡等，有助于腫瘤診斷及治療［12］。

lncRNA 是長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA。研究表明，lncRNA 在炎癥、自身免疫及腫瘤等多種疾病中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用，lncRNA 的異常表達(dá)影響疾病的發(fā)生發(fā)展［13］。lncRNA XIST 結(jié)構(gòu)上具有X 染色體滅活中心域，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的參與調(diào)控哺乳動(dòng)物雌性早期發(fā)育過(guò)程X染色體失活的非編碼RNA。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌［4］、胃癌［5］等多種腫瘤中l(wèi)ncRNA XIST 表達(dá)升高，其通過(guò)表觀遺傳學(xué)調(diào)控下游上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因如E-鈣黏素、N-鈣黏素等的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的惡性增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［14］。本研究中，結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA XIST 表達(dá)升高，可能與調(diào)控其表達(dá)的上游分子異常有關(guān)。多數(shù)長(zhǎng)非編碼基因由RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，并且具有組織和時(shí)間的特異性，腫瘤發(fā)生時(shí)某些因子如lncRNA增強(qiáng)子相關(guān)因子，能夠促進(jìn)RNA 聚合酶Ⅱ結(jié)合到lncRNA XIST基因啟動(dòng)子區(qū)域，導(dǎo)致 lncRNA XIST 表達(dá)升高［15］。此外，lncRNA XIST 表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)，其原因可能是lncRNA XIST 的過(guò)表達(dá)能夠通過(guò)分子海綿抑制miR-137 的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致notch1 的過(guò)度激活，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞之間上皮性標(biāo)志E-鈣黏素表達(dá)，而升高間質(zhì)性表型如N-鈣黏素、波形蛋白等的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移能力［16］。miRNA 是長(zhǎng)度為19～25 個(gè)核苷酸RNA 分子，可構(gòu)成RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC），RISC 結(jié)合靶基因mRNA 的3"非編碼區(qū)（UTR），通過(guò)影響mRNA 進(jìn)而達(dá)到調(diào)控基因的效果。miR-32-5p 是一種發(fā)揮腫瘤抑制功能的miRNA。研究表明，miR-32-5p 在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中表達(dá)降低，導(dǎo)致其下游癌基因ERBB2 轉(zhuǎn)導(dǎo)子1 的表達(dá)增加，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖及浸潤(rùn)能力［6，17］。本研究中，結(jié)腸癌組織中 miR-32-5p 表達(dá)較癌旁組織低，其機(jī)制是miR-32-5p 的表達(dá)受ln?cRNA，如lncRNA GAS5 的表達(dá)調(diào)控。有研究表明，結(jié)直腸癌中l(wèi)ncRNA GAS5 的表達(dá)增加，而lncRNA GAS5 能作為分子海綿結(jié)合并抑制miR-32-5p 的表達(dá)，導(dǎo)致癌組織中 miR-32-5p 表達(dá)降低［18］；此外，結(jié)腸癌高腫瘤分期患者miR-32-5p 表達(dá)低于低分期患者，提示miR-32-5p 低表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌的疾病進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，miR-32-5p 能結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子Kruppel 樣因子 4（KLF4）mRNA 的 3"UTR，促進(jìn) KLF4 mRNA 的降解，抑制KLF4 的表達(dá)。但腫瘤發(fā)生時(shí)，腫瘤細(xì)胞中miR-32-5p 表達(dá)降低，導(dǎo)致KLF4 的表達(dá)升高，而KLF4促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)癌基因如周期素D1等的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)［19］。

表1 結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA XIST、miR-32-5p及EZH2表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

EZH2 作為多梳蛋白家族成員之一，在胚胎發(fā)育的早期能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖及分化功能［20］。近年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，EZH2 基因的持續(xù)激活能夠促進(jìn)細(xì)胞的惡性增殖及轉(zhuǎn)化，可能是腫瘤重要的致癌基因。機(jī)制上，EZH2 參與構(gòu)成組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，促進(jìn)組蛋白賴氨酸甲基化，抑制多種P53 等抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［21］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中EZH2 表達(dá)上調(diào)，這可能與miRNA 對(duì)EZH2 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)。WANG 等［22］研究表明，結(jié)腸癌發(fā)生時(shí)抑制EZH2 表達(dá)的miRNA 如miR-600 表達(dá)降低，引起腫瘤中EZH2 的表達(dá)升高。此外，結(jié)腸癌中EZH2 的表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)。可能原因是腫瘤發(fā)生時(shí)EZH2 的表達(dá)升高，引起組蛋白去乙酰化酶的活性降低、P53基因H3K27位點(diǎn)的甲基化水平增加，導(dǎo)致P53 基因的G2/M 期周期阻滯功能喪失、腫瘤細(xì)胞的增殖及浸潤(rùn)能力提高［23］。

本研究進(jìn)一步分析結(jié)腸癌中l(wèi)ncRNA XIST、miR-32-5p 及EZH2 表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示ln?cRNA XIST 與 miR-32-5p 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，miR-32-5p 與EZH2 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其機(jī)制可能是lncRNA XIST 能夠作為分子海綿結(jié)合并抑制miR-32-5p 的表達(dá)，導(dǎo)致miR-32-5p 水平降低，而miR-32-5p 能夠特異性結(jié)合并抑制EZH2的表達(dá)，即lncRNA XIST 能夠通過(guò)miR-32-5p/EZH2 分子軸促進(jìn)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移［9］。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中l(wèi)ncRNA XIST 與EZH2表達(dá)上調(diào)，而miR-32-5p 表達(dá)下調(diào)，癌組織中l(wèi)n?cRNA XIST、miR-32-5p 及 EZH2 表達(dá)與腫瘤分期有關(guān)，lncRNA XIST、miR-32-5p 及 EZH2 三者共同參與結(jié)腸癌的惡性進(jìn)展。但三者的具體作用機(jī)制及臨床應(yīng)用價(jià)值仍需深入研究。