結(jié)腸癌組織中miR-520a、RAB22A表達(dá)變化及意義

鄧曉蘭，強(qiáng)金虎，劉靚，朱靈，崔英

無錫市錫山人民醫(yī)院，江蘇無錫214105

結(jié)腸癌是常見的腸道上皮源性惡性腫瘤，其發(fā)病率較高，且預(yù)后不良，嚴(yán)重危害人類生命安全。結(jié)腸癌具有起病隱匿和易轉(zhuǎn)移等特點，常導(dǎo)致患者治療不及時或術(shù)后復(fù)發(fā)，因此，為改善患者預(yù)后和提高治療效率，深入探尋結(jié)腸癌致病機(jī)制迫在眉睫［1］。微小RNA（miRNA）屬于內(nèi)源性非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，通過結(jié)合3"非翻譯區(qū)對細(xì)胞增殖和凋亡等生命活動具有重要意義［2］。miR-520a屬于miR-520家族，位于19號染色體，主要存在于人類未分化的胚胎干細(xì)胞中，能夠參與調(diào)控干細(xì)胞的極性［3］。研究［3］發(fā)現(xiàn)，抑制 miR-520a 表達(dá)能夠使慢性髓細(xì)胞樣白血病的耐藥性增加，間接表明miR-520a起抑癌基因作用。RAB22A 屬于Rab 家族，其本質(zhì)是一種GTP 酶，主要位于具有合成或分泌功能的細(xì)胞器內(nèi)，在運輸?shù)鞍缀托盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)方面具有重要作用［4］。據(jù)相關(guān)研究報道［4］，上調(diào)的RAB22A 能夠改變細(xì)胞核形狀，使高爾基體和細(xì)胞核的信號傳遞與分子交流受阻，在乳腺癌等多種惡性腫瘤中均起到促癌基因的作用。miR-520a和RAB22A在結(jié)腸癌中報道少見，因此本研究觀察了結(jié)腸癌組織中miR-520a和RAB22A的表達(dá)變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析本院2017 年2 月—2019 年6 月收治的77 例結(jié)腸癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：入選患者均遵循《世界衛(wèi)生組織腫瘤分類診斷系統(tǒng)》［5］中的標(biāo)準(zhǔn)原則且術(shù)后病理顯示均為結(jié)腸癌；均為首次診斷，且無腸道手術(shù)既往史或放化療史；患者基本信息完整，且自愿接受本次試驗。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他嚴(yán)重腸道疾病或原發(fā)惡性腫瘤者；凝血功能異常者；肝腎功能失代償者；自身免疫系統(tǒng)存在缺陷者。其中男 37 例、女 40 例，年齡（57.13 ±6.39）歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移67 例；低分化6例、高分化39例、中分化32例；TNM 分期Ⅰ期 38 例、Ⅱ期 30 例、Ⅲ期 7 例、Ⅳ期 2 例；腫瘤直徑≤5 cm 者 47 例，>5 cm 者 30 例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且所有受試者均在知情同意書上簽字。

1.2 miR-520a 和RAB22A 檢測 采用熒光實時定量PCR 技術(shù)。術(shù)中分別切取癌組織及其癌旁正常組織（距病灶5 cm 處），經(jīng)液氮暫存后統(tǒng)一保存于-80 ℃冰箱。各取兩種組織30 mg，在冰上研磨均勻后加入1 mL TRIzol 試劑（Invitrogen 公司），遵循相關(guān)操作步驟提取總RNA。將提取的10 μg 總RNA 通過PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa 公司）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（TaKa?Ra 公司）定量檢測miR-520a 和RAB22A。miR-520a和 RAB22A 的反應(yīng)條件均為 42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。PCR 擴(kuò)增體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、上下游引物均為0.8μL、cDNA template 2μL、dH2O 6μL及熒光顯影劑0.4 μL，共計20 μL。上海生工生物公司負(fù)責(zé)設(shè)計所有引物序列。miR-520a 的正向引物序列為5"-GGGGAAAGTGCTTCCCTTT-3"、反向引物序列為5"-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3"，內(nèi)參基因U6 的正向引物序列為5"-GCTTCGGCAGCA?CATATACTAAAAT-3"、反向引物序列為5"-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3"；RAB22A 正向引物序列為5"-TTGTAGCCATTGCAGGA-3"、反向引物序列為 5"-AGGCTGTCTTCGGAGTTTGA-3"，內(nèi) 參 基 因β-actin 正向引物序列為5"-ATGTGCGACGACGAT?GTTG-3"、反 向 引 物 序 列 為 5"-CTCGTTG?TAGAAGGTGTGG-3"。miR-520a 和 RAB22A 的 PCR反應(yīng)條件均為 94 ℃ 5 min、變性 94 ℃ 30 s、退火62 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s，共擴(kuò)增40個循環(huán)，每個樣本均測量 3 次。以 2-ΔΔCt法計算 miR-520a 和 RAB22A的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以-x±s表示，兩兩比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析；相關(guān)性檢驗應(yīng)用Pearson 相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織及其癌旁正常組織中miR-520a 和RAB22A 表達(dá)比較 結(jié)腸癌組織及其癌旁正常組織中miR-520a 的相對表達(dá)量分別為0.56 ± 0.22、1.61 ± 0.53，RAB22A 的相對表達(dá)量分別為 4.12 ±1.46、1.33±0.54，結(jié)腸癌組織中RAB22A的相對表達(dá)量較癌旁正常組織升高，而miR-520a 的相對表達(dá)量較癌旁正常組織降低（t=15.727，P<0.01；t=16.056，P<0.01）。

2.2 結(jié)腸癌組織中miR-520a 和RAB22A 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)腸癌組織中miR-520a 和RAB22A 的表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)（P均<0.05），而與患者性別、腫瘤直徑以及年齡無關(guān)（P均>0.05）。見表1。

表1 結(jié)腸癌組織中miR-520a和RAB22A的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 結(jié)腸癌組織中miR-520a 和RAB22A 表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)腸癌組織中miR-520a 的表達(dá)和RAB22A的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.756，P<0.01）。

3 討論

結(jié)腸癌是危及生命的上皮源性惡性腫瘤，其發(fā)病率在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家均呈上升趨勢。據(jù)循證醫(yī)學(xué)統(tǒng)計，每年約有100萬例首次診斷為結(jié)腸癌，而死于結(jié)腸癌患者約50 萬例［6］。家族遺傳、飲食習(xí)慣、地區(qū)差異以及基因易感性均可能對結(jié)腸癌發(fā)病產(chǎn)生不同程度的影響。目前，化療輔助手術(shù)切除仍是治療結(jié)腸癌的首選方式，但常因結(jié)腸毗鄰器官眾多且周圍淋巴結(jié)和血供豐富，常伴腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，因此治療效果較差［7］。盡管目前臨床應(yīng)用的一些腫瘤指標(biāo)（如：糖類抗原和癌胚抗原）對診斷結(jié)腸癌有一定幫助，但其特異性和敏感度均較低，因此，不斷深化探索結(jié)腸癌的致病機(jī)制對輔助診斷及提高治療效率至關(guān)重要。近年來，分子生物學(xué)和基因組學(xué)技術(shù)不斷成熟，人們逐步認(rèn)識到抑癌基因和原癌基因的異常表達(dá)是正常細(xì)胞惡變?yōu)榘┘?xì)胞的重要環(huán)節(jié)。相關(guān)研究報道，組蛋白修飾、DNA 甲基化及非編碼RNA 均能夠參與細(xì)胞分裂和分化，從而影響腫瘤的發(fā)病及演變［8-9］。

miRNA 是由21～23 核苷酸分子組成的非編碼RNA，主要存在于真核細(xì)胞中，能夠以堿基配對的形式結(jié)合3"非翻譯區(qū)，從而抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后續(xù)翻譯或直接剪接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，對靶基因的表達(dá)具有重要調(diào)控作用［10］。miR-520a 在胚胎干細(xì)胞中呈高表達(dá)，并參與干細(xì)胞功能的調(diào)控。研究表明，miR-520a 在食管鱗癌中通過抑制ErbB4 基因促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，使其轉(zhuǎn)移和侵襲能力減弱［11］。本研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌組織中miR-520a 表達(dá)較癌旁正常組織降低。其原因可能為癌組織中抑癌蛋白表達(dá)失活，從而抑制E2F1蛋白，而E2F1是重要的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)下調(diào)能導(dǎo)致miR-520a 的啟動子沉默，使其轉(zhuǎn)錄受阻，最終下調(diào)miR-520a 表達(dá)［12］。本研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌組織中miR-520a 的表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)，表明miR-520a參與結(jié)腸癌致病過程及癌癥進(jìn)展。其機(jī)制可能為下調(diào)的miR-520a 對PIK3CA 的抑制作用減弱，從而使PIK3CA 表達(dá)上調(diào)，激活PI3K/AKT 信號通路，縮短G0/G1期，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)其遷移和黏附能力［9］。此外，miR-520a 被抑制后，通過調(diào)控 STAT3、E2F7 及MAP3K2等基因或信號通路，減少癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)癌細(xì)胞的耐藥性，使癌細(xì)胞的分化和侵襲能力增強(qiáng)［13］。

RAB22A 是由 180～200 個氨基酸組成的 GTP 結(jié)合蛋白，主要包括可變的C 端、N 端和穩(wěn)定的G 結(jié)構(gòu)域，廣泛存在于真核細(xì)胞的含膜細(xì)胞器中，對胞吞作用、囊泡運輸、細(xì)胞核組裝以及形成細(xì)胞骨架至關(guān)重要［14］。既往研究表明，RAB22A 通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、調(diào)控外泌體分泌以及激活金屬蛋白酶使腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移增強(qiáng)［15］。本研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌組織中RAB22A的表達(dá)較癌旁正常組織升高。其機(jī)制可能為具有無限增殖能力的癌細(xì)胞中帶膜細(xì)胞器活性增強(qiáng)，而RAB22A主要存在于含膜細(xì)胞器中，因此RAB22A 表達(dá)會上調(diào)；同時癌組織內(nèi)早期內(nèi)體抗原（EEA1）活性增強(qiáng)，而EEA1 能夠加速合成RAB22A 的轉(zhuǎn)錄翻譯過程，從而使RAB22A 表達(dá)上調(diào)［16］。本研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌組織中RAB22A 的表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM 分期有關(guān)，表明RAB22A 表達(dá)也參與結(jié)腸癌的癌變進(jìn)展過程。研究表明，癌細(xì)胞中高表達(dá)的RAB22A 能夠激活Rab5，從而形成 Rab22-Rabex-5-Rab5 聯(lián)合體，使表皮生長因子降解，并誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使癌細(xì)胞易于侵襲和分化，同時RAB22A 上調(diào)能夠使癌細(xì)胞的代謝能力增強(qiáng)，從而加速癌細(xì)胞的分裂和分化［15］。此外，RAB22A 能夠促進(jìn)CD147 的表達(dá)，活化相關(guān)腫瘤膠原酶并誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶合成，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力和對細(xì)胞外基質(zhì)的穿透性，最終促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移及侵襲。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中miR-520a 表達(dá)和RAB22A 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明癌組織中miR-520a的下調(diào)可能使抑制RAB22A 表達(dá)的能力減弱，從而使腫瘤易于形成和進(jìn)展。盡管目前并無具體機(jī)制闡述miR-520a 和RAB22A 相關(guān)關(guān)系，但是已有研究證明 miR-203、miR-373 以 及 miR-193b 均 能 夠 抑 制RAB22A 的表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)藥物治療療效［16］。此外，RAB22A 和 miR-520a 均可作用于TGF-β信號通路，然而受本次試驗設(shè)備限制，miR-520a 調(diào)控RAB22A 的具體機(jī)制尚不清楚，需要日后進(jìn)一步探索［12，17］。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中RAB22A 表達(dá)升高，而miR-520a 表達(dá)降低，二者均與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)，共同參與結(jié)腸癌進(jìn)展。