miR-363-5p抑制BRD4表達對鼻咽癌細胞增殖和凋亡的影響

沈永華，程澤星，汪峻峰，王敏

揚州大學附屬醫院，江蘇揚州225000

鼻咽癌是一種源于鼻咽部上皮細胞的頭頸部腫瘤，常伴有早期遠處轉移和局部侵襲，主要發生在中國南部和東南亞［1］。Epstein-Barr 病毒感染、腫瘤抑制因子、癌基因和環境因素等與鼻咽癌的發生有關，但其發病機制仍有待完全闡明［2］。盡管過去幾十年治療措施有了很大改善，但鼻咽癌的5 年生存率仍然很低［3］。因此，探索鼻咽癌的發病機制對于確定最佳治療策略至關重要。微小RNA（miRNA）是一類由19～25 個核苷酸組成的小的非蛋白質編碼RNA，其可通過與靶mRNA 的3"非翻譯區（3"UTR）配對結合來抑制轉錄后水平靶基因的表達。在各種人類癌癥的發生和發展過程中，表達失調的miRNA可作為致癌基因或腫瘤抑制因子發揮作用［4］。miR?NA 在鼻咽癌許多關鍵生物過程中發揮重要的調節作用，如細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移、放射敏感性和化學敏感性［5-6］。研究發現，miR-363-5p 在多種癌癥包括肝細胞癌、卵巢癌、腎細胞癌等中起腫瘤抑制劑的作用［7-9］。CHAPMAN 等［10］報道 miR-363 靶向肌球蛋白1B 以減少頭頸癌中的細胞遷移。但miR-363-5p 在鼻咽癌中的作用及分子機制尚不十分清楚。因此 2018 年 4—10 月，本實驗檢測了 miR-363-5p 在不同鼻咽癌細胞中的表達情況，觀察了miR-363-5p對鼻咽癌細胞增殖和凋亡的影響，并對其潛在的分子機制進行初步探討，以期為鼻咽癌的治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常鼻咽上皮細胞NP-69 及鼻咽癌細胞 5-8F、CNE1、CNE2Z 和C666-1 均購于中國科學院上海細胞庫；miR-363-5p mimics 及陰性對照購于廣州銳博生物科技有限公司；DMEM 培養基購于美國Sigma 公司；胰蛋白酶及胎牛血清購于美國Gibco公司；青—鏈霉素雙抗購于杭州四季青生物工程材料有限公司；RNA 提取試劑、MTT 試劑及脂質體Lipofectamine2000 轉染試劑購于美國Invitrogen 公司；逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR 檢測試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI 雙染色細胞凋亡檢測試劑盒購于日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于北京普洛麥格生物技術有限公司，熒光素酶報告重組載體由該公司完成；Bax一抗、Cleaved Caspase-3一抗及BRD4一抗購于美國CST 公司；GAPDH 一抗及辣根過氧化酶標記的IgG 購于美國Santa cruz 公司；實驗所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細胞培養和轉染 將人正常鼻咽上皮NP-69細胞及鼻咽癌5-8F、CNE1、CNE2Z 和 C666-1 細胞培養在含10%滅活胎牛血清、100 U/mL 青—鏈霉素雙抗的DMEM 培養基中，置5%CO2、37 ℃培養箱中，及時更換新的培養液，每隔2 d 傳代1 次，取對數生長期的細胞用于實驗。將對數增殖期的鼻咽癌5-8F細胞以3×103個/孔種植到6 孔板中，過夜培養，待細胞生長密度至50%左右時根據Lipofectamine2000轉染試劑使用手冊進行轉染，將轉染miR-363-5p mim?ics的5-8F細胞作為miR-363-5p組，轉染陰性對照的5-8F 細胞作為NC 組，未進行轉染處理的5-8F 細胞作為Control 組。各組5-8F 細胞轉染6 h 后更換為含10%胎牛血清的DMEM 培養液，在37 ℃培養箱中繼續培養48 h。

1.3 細胞中miR-363-5p 檢測 采用qRT-PCR。處于對數生長期的正常鼻咽上皮細胞NP-69 及鼻咽癌細胞5-8F、CNE1、CNE2Z和C666-1分別使用RNA提取試劑提取總RNA，采用同樣的方法提取轉染48 h 后各組5-8F 細胞中總RNA。分別檢測RNA 的純度和濃度，取合格的總RNA 1μg以逆轉錄試劑盒進行cDNA 合成，調整cDNA 濃度，使用熒光定量PCR檢測試劑盒，以U6 為內參進行PCR 擴增，反應體系：cDNA 2 μL，2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物分別1 μL，ddH2O 6 μL。qRT-PCR 實驗所用 引 物 U6 F：5"-GCTTCGGCAGCACATATACTA?AAAT-3"，R：5"-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3"；miR-363-5p F：5"-GGTCCAGATCTACATGCGT-3"，R：5"-CAGTCGTTGCGGGTGAGT-3"。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40 個循環。反應結束后獲取實驗數據以2-ΔΔCt法計算各細胞中miR-363-5p的相對表達量。

1.4 細胞增殖能力檢測 采用MTT 實驗。取對數期的5-8F 細胞，以胰蛋白酶消化，收集細胞并制成細胞懸液，接種到96 孔板中，接種密度為1×103個/孔。待細胞生長密度在50%時以1.2方法進行轉染和分組，分別在24、48、72 h 時向各孔細胞加入MTT檢測液100μL，充分混勻后在37 ℃下繼續孵育4 h，再加入150μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩反應至沉淀充分溶解，在酶標儀450 nm 波長處測定各孔細胞光密度值（OD 值），實驗重復3 次。以OD 值代表細胞的增殖能力。

1.5 細胞凋亡率檢測 采用Annexin V/PI 雙染色。取轉染48 h 后各組5-8F 細胞，以胰酶消化，離心并收集約1×104個細胞。加入Binding buffer 結合緩沖液100μL 懸浮細胞，向細胞懸液中加入Annexin VFITC 溶液5μL，混勻后孵育5 min，再向細胞中加入PI 染液5 μL，輕輕混勻，室溫避光反應15 min，立即上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，實驗重復3次。

1.6 miR-363-5p 與BRD4 表達關系驗證 采用雙熒光素酶報告基因實驗。使用生物信息學在線數據庫TargetScan 等預測miR-363-5p 的靶基因，結果顯示BRD4 3"UTR 與miR-363-5p 存在靶向結合位點，提示BRD4 可能是miR-363-5p 的直接靶基因。分別擴增并構建含野生型BRD4 3"UTR（BRD4-Wt）及突變型BRD4 3"UTR（BRD4-Mut）的熒光素酶重組載體，該部分由北京普洛麥格生物技術有限公司完成。將BRD4-Wt 或BRD4-Mut 重組載體分別與miR-363-5p mimic 及陰性對照共轉染5-8F 細胞，48 h 后使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定熒光素酶活性，計算細胞相對熒光活性，實驗重復3次。

1.7 Bax、Cleaved Caspase-3 和 BRD4 蛋白檢測 采用Western blotting 法。轉染48 h各組5-8F細胞以胰酶消化，收集細胞并提取總蛋白，使用BCA 蛋白濃度檢測試劑盒對蛋白樣品進行定量，取等量蛋白加入到上樣孔，行SDS-PAGE 電泳，蛋白分離后轉印至PVDF 膜上，在封閉液中室溫孵育1 h，TBST 洗膜后分別加入相應一抗［Bax 一抗（1∶800），Cleaved Cas?pase-3 一抗（1∶800），BRD4 一抗（1∶500）］，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后再加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h。TBST 洗膜后使用ECL 顯影液進行顯影，在凝膠成像系統中成像拍照，以GAPDH 用于蛋白的內參對照，采用ImageJ 軟件分析目的蛋白相對表達量，實驗重復3次。

1.8 統計學方法 采用SPSS21.0 統計軟件。多組間比較采用單因素方差分析或重復測量方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各種細胞中miR-363-5p 表達比較 正常鼻咽上皮細胞NP-69 及鼻咽癌細胞5-8F、CNE1、CNE2Z、C666-1 中miR-363-5p 的相對表達量分別為1.00 ±0.10、0.16 ± 0.02、0.38 ± 0.04、0.40 ± 0.04 和0.62 ± 0.06，與 NP-69 相比，5-8F、CNE1、CNE2Z 和C666-1 中 miR-363-5p 的表達下調（P均<0.05）。鼻咽癌細胞5-8F 中miR-363-5p 的相對表達量最低，因此選其作為后續實驗的研究對象。

2.2 鼻咽癌5-8F 細胞轉染miR-363-5p mimics 效果檢測 Control 組、NC 組和 miR-363-5p 組 5-8F 細胞中miR-363-5p 的相對表達量分別為1.00 ± 0.11、0.99 ± 0.10、3.02 ± 0.33，miR-363-5p 組 miR-363-5p表達低于NC組（P<0.05），而Control組和NC組比較差異無統計學意義。

2.3 過表達miR-363-5p 對5-8F 細胞增殖能力的影響 miR-363-5p 組5-8F 細胞增殖能力低于NC 組（P<0.05），而Control 組和NC 組比較差異無統計學意義。見表1。

表1 過表達miR-363-5p對5-8F細胞增殖能力的影響（±s）

表1 過表達miR-363-5p對5-8F細胞增殖能力的影響（±s）

注：與NC組相比，*P<0.05。

組別Control組NC組miR-363-5p組F P細胞增殖能力24 h 0.26±0.02 0.25±0.02 0.20±0.02*23.250<0.01 48 h 0.58±0.06 0.55±0.05 0.32±0.03*78.043<0.01 72 h 0.76±0.08 0.75±0.07 0.40±0.04*87.977<0.01

2.4 過表達miR-363-5p對5-8F細胞凋亡的影響miR-363-5p 組、Control 組、NC 組細胞凋亡率分別為（23.75 ± 5.28）%、（7.04 ± 2.16）%、（7.33 ± 2.46）%，miR-363-5p 組高于 NC 組（P<0.05），而 Control 組和NC 組比較差異無統計學意義。miR-363-5p 組5-8F細胞中Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達高于NC組（P均<0.05），而 Control 組和NC 組比較差異均無統計學意義。見表2。

表2 過表達miR-363-5p對5-8F細胞Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響（±s）

表2 過表達miR-363-5p對5-8F細胞Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響（±s）

注：與NC組相比，*P<0.05。

組別Control組NC組miR-363-5p組F P Bax蛋白0.33±0.04 0.35±0.04 0.67±0.07*121.333<0.01 Cleaved Caspase-3蛋白0.16±0.02 0.15±0.02 0.71±0.07*486.474<0.01

2.5 miR-363-5p 與 BRD4 表達的關系 miR-363-5p mimics、陰性對照與BRD4-Wt共轉染細胞相對熒光活性分別為1.00±0.10、0.31±0.03，兩者相比P<0.05；miR-363-5p mimics、陰性對照與 BRD4-Mut共轉染細胞相對熒光活性［（1.00± 0.09）vs（0.98±0.09）］比較差異無統計學意義。miR-363-5p組5-8F細胞中 BRD4 蛋白表達（0.32 ± 0.03）低于 NC 組（0.14 ± 0.01），P<0.05。

3 討論

miRNA 作為重要的調節因子，已被證明在多種腫瘤的各種惡性生物學行為中起關鍵作用，包括鼻咽癌的增殖和凋亡。據報道，miRNA 通過靶向不同的基因或信號通路在鼻咽癌及其預后中起重要作用，如 miR-23a、miR-379、miR-142、miR-26a 和 miR-141 等［11-13］。miR-363 在多種癌癥中顯著下調，起腫瘤抑制因子的作用。本研究發現miR-363-5p 在鼻咽癌細胞系中的表達低于正常鼻咽上皮細胞，與先前 CHEN 等［14］報道中的趨勢相符。WANG 等［15］研究發現，miR-363-3p 通過靶向肺腺癌中增殖細胞核抗原的表達抑制腫瘤生長。在骨肉瘤組織中miR-363-3p 表達下調，過表達miR-363-3p 可通過靶向調控SOX4 的表達顯著抑制骨肉瘤U2OS 和MG63 細胞的增殖、遷移和侵襲［16］。在肝癌細胞中，miR-363 通過直接靶向E2F 轉錄因子3 的表達來抑制肝細胞癌細胞的生長、遷移和侵襲［17］。ZHANG 等［18］報道 hsamiR-363-5p的低表達與肝細胞癌患者的總體存活呈負相關，提示miR-363-5p 可能是肝細胞癌的潛在預后標志物。此外，miR-363 介導的HMGA2 表達負向調節非小細胞肺癌的發生和進展［19］。為了深入了解miR-363-5p 在鼻咽癌發病機制中的作用，本實驗分析了miR-363-5p 對鼻咽癌5-8F 細胞增殖和凋亡的影響，結果發現miR-363-5p 過表達能夠抑制細胞增殖并促進細胞凋亡。眾所周知，促凋亡蛋白Bax 屬于Bcl-2家族的成員，其在凋亡過程中調節線粒體功能。當細胞處于應激狀態時，會發生膜變化，從而導致凋亡因子釋放到細胞質中，包括細胞色素C。細胞色素C 的增加會激活caspase-3，導致細胞凋亡加速。本實驗結果顯示，miR-363-5p 過表達能夠促進Bax和Cleaved Caspase-3的表達，表明miR-363-5p過表達可通過上調Bax 和Cleaved Caspase-3 的表達促進細胞凋亡。以上這些結果表明miR-363-5p 在鼻咽癌中可能發揮腫瘤抑制的功能。

miRNA 通常通過堿基配對與其靶基因相互作用來發揮其功能。本研究前期預實驗通過生物信息學手段預測發現BRD4 是miR-363-5p 的直接靶基因。雙熒光素酶報告基因實驗驗證了BRD4是miR-363-5p 靶基因。BRD4 屬于兩個串聯溴結構域和含有額外末端結構域的家族蛋白，它們已成為基因轉錄和癌癥發展的重要表觀遺傳調節因子。BRD4 可通過調節癌癥促進因子的表達和活性來調節癌細胞的多種特性，包括細胞增殖、凋亡、轉化、侵襲和耐藥性［20］。BRD4 在多種實體瘤包括胰腺癌、乳腺癌和結腸直腸癌等中過表達，BRD4 的表達抑制能夠阻礙這些癌細胞增殖和侵襲［21-23］。目前BRD4 已成為癌癥治療中有前景的治療靶點［24］。SHEN 等［25］通過體內及體外實驗證實，BRD4 表達抑制可抑制人前列腺癌細胞的生長。在甲狀腺癌組織中BRD4 的表達明顯高于對應癌旁組織，沉默BRD4 后能夠抑制甲狀腺癌 TPC-1 細胞的增殖、活力、侵襲和遷移［26］。BRD4 特異性抑制劑GSK525762A 能夠抑制鼻咽癌CNE-2細胞增殖和侵襲，并誘導CNE-2細胞凋亡［27］。本實驗結果顯示，過表達miR-363-5p 鼻咽癌5-8F 細胞中BRD4 的表達降低，提示miR-363-5p 能夠負向調控BRD4的表達。

綜上可見，miR-363-5p 對鼻咽癌細胞的增殖有一定的抑制作用，并可促進細胞凋亡；miR-363-5p可能通過靶向負調控BRD4 參與鼻咽癌的調控機制。但miR-363-5p 在鼻咽癌中的具體作用機制仍需深入探究，后續實驗將在多株鼻咽癌細胞及動物模型中進一步探討。