買麻藤下調LINC00673 表達對肝癌細胞增殖、遷移和細胞周期的影響

方健，王辰男，孟慶剛

北京中醫藥大學，北京100029

肝癌是全球范圍內與癌癥相關死亡的重要原因之一。2018年，我國報告的肝癌新增病例超過39萬例［1］。肝癌的治療方法包括手術切除、放療、肝移植和化學治療［2］。手術切除是治療肝癌的最常見方法，但術后仍存在復發。因此，需要詳細了解肝癌的機制，以制定有效的治療策略。買麻藤系買麻藤科植物買麻藤或小葉買麻藤的干燥藤莖，是一種具有抗腫瘤、抗氧化作用的中草藥［3］，其乙醇提取物對肝癌BEL-7402 細胞和白血病HL-60 細胞的生長具有良好的抑制作用［4］。然而買麻藤在肝癌中的作用研究較少。長鏈非編碼RNA（lncRNA）為長度超過200 nt的非編碼RNA［5］。研究表明，lncRNA與肝癌的發生發展有關［6］，其中包括LINC00673。LINC00673 已成為癌癥發展和進展的重要調節劑，可以促進上皮性卵巢癌的增殖和轉移［7］。LINC00673在肝癌癌組織和細胞系中高表達，與預后差和生存率低有關。且LINC00673的沉默抑制肝癌細胞的體外增殖、侵襲和上皮—間質轉化［8］。但LINC00673 是否參與買麻藤調節肝癌細胞的增殖轉移和細胞周期過程，目前仍未可知。2019年5月—2020年6月，本研究旨在探討買麻藤對肝癌細胞增殖、遷移和周期的影響，并通過LINC00673進一步探討其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞Huh-7 購自美國模式菌種收集中心，胎牛血清（FBS）、Dulbecco 改良的Eagle 培養基（DMEM 培養基）、磷酸鹽緩沖液（PBS）購自美國Gibco 公司，LINC00673 過表達質粒 pcDNALINC00673、過表達空載質粒pcDNA 購自上海Ge?nePharma 公司，噻唑藍（MTT）購自Sigma-Aldrich 公司，SYBR Green PCR 試劑盒購自大連TaKaRa 公司，雙辛可寧酸（BCA ?）蛋白測定試劑盒購自美國Pierce 公司，細胞核相關抗原 Ki-67 抗體、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體、辣根過氧化物酶綴合的IgG 二抗購自上海Abcam 公司。買麻藤提取物參照姚柳利等［4］的報道制備，即取買麻藤藥材粉末（200 g），以1∶10 的料液比加入70%乙醇，回流提取2 h，重復3 次，合并濾液減壓濃縮成膏狀，之后用蒸餾水作溶劑，乙酸乙酯萃取，合并6 次的濾液，濃縮至浸膏，經聚酰胺柱色譜分離，真空冷凍干燥，得到深褐色粉末狀物。實驗時，采用DMEM 培養基將買麻藤稀釋成所需濃度20、40、60 ng/mL。

1.2 細胞培養與實驗分組 將Huh-7 細胞與含10% FBS 的 DMEM 培養基一起孵育，在 37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。實驗分組：將Huh-7細胞分為對照組、買麻藤低劑量組、買麻藤中劑量組、買麻藤高劑量組、買麻藤高劑量+pcDNA 組、買麻藤高劑量+pcDNA-LINC00673 組共6 組。其中，對照組Huh-7 細胞未處理，買麻藤低、中、高劑量組分別以20、40、60 ng/mL 買麻藤作用 48 h。買麻藤高劑量+pcDNA 組、買麻藤高劑量+pcDNA-LINC00673 組細胞以每孔3×105個的密度接種在6 孔板中，并在DMEM 完全培養基中生長24 h，直到融合率達到80%～90%，之后將Huh-7 細胞用新鮮培養基沖洗，并 分 別 與 pcDNA、pcDNA-LINC00673 和 Lipo?fectamine2000孵育4～6 h，將轉染培養基更換為新鮮培養基，并以60 ng/mL買麻藤處理48 h。

1.3 細胞存活率測算 采用MTT 法。各組Huh-7細胞處理結束后，將其接種于96 孔中，每孔2×104個細胞，48 h 后，將MTT（終濃度為5 mg/mL）添加到每孔中，并孵育2 h。去除培養基，使用100μL 二甲基亞砜（DMSO）溶解深藍色的甲瓚沉淀，并使用酶標儀在490 nm 處評估Huh-7細胞的光密度（OD）值，計算細胞存活率（%）。存活率（%）=實驗OD 值/對照OD值×100%。

1.4 細胞克隆形成檢測 在克隆形成測定中，將各組Huh-7 細胞以每孔600 個細胞的密度接種在6 孔板中。經過14 d 左右，用甲醇固定并用結晶紫染色直至細胞克隆可見。計算形成克隆的細胞數。

1.5 細胞周期檢測 采用流式細胞術。收集各組Huh-7細胞1×105個，用70%乙醇固定，4 ℃過夜。然后將Huh-7 細胞與含10 μL RNase A 的碘化丙啶工作液孵育，37 ℃保持30 min。之后通過流式細胞儀在488/575 nm 激發/發射波長下檢測細胞周期，并通過 FlowJ 軟件分析數據，得出 G0+G1、S、G2+M 期細胞比例。

1.6 細胞中LINC00673 表達檢測 采用實時熒光定量PCR。用TRIzol 試劑提取各組Huh-7 細胞的總RNA，通過OD260/OD280值確定提取的RNA 的濃度和質量。使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，定量SYBR Green PCR 試劑盒進行PCR。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）用作內部參考。LINC00673 引物：正向序列為 5"-AATATTAAACGGTCCAGTCCTACAA-3"，反向序列為5"-TAGGACTGCCCATTACAGAGGA-3"。GAPDH 引物：正向序列為5"-CGACTTATACATG?GCCTTA-3"，反向序列為 5"-TTCCGATCACTGTTG?GAAT-3"。采 用 2-ΔΔCt法 計算 LINC00673 的相 對 表達量。

1.7 細胞遷移檢測 采用Transwell 法。收集各組Huh-7 細胞。在遷移實驗中，將包含1×105個Huh-7細胞的500 μL 無血清DMEM 培養基加入Transwell設備的上腔室。接下來，將 700 μL 含 10% FBS 的DMEM 培養基加入下腔室。24 h 后，將膜下側的Huh-7細胞染色，并在顯微鏡下高倍視野中計數。

1.8 細胞中 Ki-67、E-cadherin、N-cadherin 蛋白檢測 采用Western blotting 法。各組Huh-7 細胞處理結束后，用PBS沖洗，并在RIPA裂解緩沖液（包括蛋白酶抑制劑）中裂解。使用BCA?蛋白測定試劑盒對獲得的總蛋白濃度進行定量。通過十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。之后，將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后與抗Ki-67、E-cad?herin、N-cadherin 和GAPDH 的一抗一起孵育，4 ℃過夜。一抗均以1∶1 000的稀釋度稀釋。洗滌膜，在室溫下用辣根過氧化物酶綴合的IgG 二抗（1∶5 000 稀釋度稀釋）在室溫下放置1 h。隨后，用Bio-Rad 的Image Lab?軟件捕獲蛋白條帶的信號。以GAPDH為對照，分析Ki-67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達。

1.9 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。計量資料以-x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組Huh-7細胞增殖情況比較 結果見表1。

2.2 各組細胞周期比較 結果見表2。

表1 各組細胞存活率和克隆形成數比較（±s）

表1 各組細胞存活率和克隆形成數比較（±s）

注：與對照組相比，aP<0.05；與買麻藤低劑量組相比，bP<0.05；與買麻藤中劑量組相比，cP<0.05；與買麻藤高劑量組相比，dP<0.05；與買麻藤高劑量+pcDNA組相比，eP<0.05。

組別對照組買麻藤低劑量組買麻藤中劑量組買麻藤高劑量組買麻藤高劑量+pcDNA組買麻藤高劑量+pcDNA-LINC00673組F P存活率（%）98.16±1.15 85.45±0.98a 71.46±0.84ab 54.86±0.86abc 54.79±0.89abc 90.91±1.15abcde 1 059.802<0.01克隆形成數（個）118.33±2.05 98.00±1.63a 69.33±1.25ab 52.67±1.25abc 53.33±1.25abc 107.00±1.63abcde 1 022.994<0.01

表2 各組細胞周期分布比較（%，±s）

表2 各組細胞周期分布比較（%，±s）

注：與對照組相比，aP<0.05；與買麻藤低劑量組相比，bP<0.05；與買麻藤中劑量組相比，cP<0.05；與買麻藤高劑量組相比，dP<0.05；與買麻藤高劑量+pcDNA組相比，eP<0.05。

組別對照組買麻藤低劑量組買麻藤中劑量組買麻藤高劑量組買麻藤高劑量+pcDNA組買麻藤高劑量+pcDNA-LINC00673組F P G0+G1期33.27±0.26 36.44±0.35a 40.62±0.52ab 44.13±0.46abc 44.17±0.45abc 33.64±0.37bcde 438.789<0.01 S期33.79±0.35 30.44±0.31a 26.22±0.33ab 22.79±0.26abc 22.85±0.26abc 32.10±0.36abcde 687.523<0.01 G2+M期32.94±0.29 33.12±0.33 33.16±0.46 33.08±0.43 32.98±0.17 33.27±0.39 0.341>0.05

2.3 各組細胞遷移情況比較 對照組、買麻藤低劑量組、買麻藤中劑量組、買麻藤高劑量組、買麻藤高劑量+pcDNA 組、買麻藤高劑量+pcDNA-LINC00673組遷移細胞數分別為（165.00 ± 2.45）、（135.33 ±2.05）、（100.33 ± 1.25）、（74.67 ± 0.94）、（75.33 ±1.25）、（146.00 ± 1.41）個，除買麻藤高劑量組與買麻藤高劑量+pcDNA 組相比無統計學差異外，各組兩兩相比P均<0.05。

2.4 各組細胞中LINC00673表達比較 對照組、買麻藤低劑量組、買麻藤中劑量組、買麻藤高劑量組、買麻藤高劑量+pcDNA 組、買麻藤高劑量+pcDNALINC00673 組中LINC00673 的相對表達量分別為1.00 ± 0.03、0.78 ± 0.02、0.60 ± 0.02、0.31 ±0.01、0.31± 0.01、0.84± 0.02，除買麻藤高劑量組與買麻藤高劑量+pcDNA 組相比無統計學差異外，各組兩兩相比P均<0.05。

2.5 各組細胞中Ki-67、N-cadherin、E-cadherin 蛋白表達比較 見表3。

表3 各組細胞中Ki-67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達比較（±s）

表3 各組細胞中Ki-67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達比較（±s）

注：與對照組相比，aP<0.05；與買麻藤低劑量組相比，bP<0.05；與買麻藤中劑量組相比，cP<0.05；與買麻藤高劑量組相比，dP<0.05；與買麻藤高劑量+pcDNA組相比，eP<0.05。

組別對照組買麻藤低劑量組買麻藤中劑量組買麻藤高劑量組買麻藤高劑量+pcDNA組買麻藤高劑量+pcDNA-LINC00673組F P Ki-67蛋白0.75±0.03 0.58±0.02a 0.40±0.02ab 0.24±0.01abc 0.23±0.01abc 0.66±0.02abcde 378.365<0.01 E-cadherin蛋白0.18±0.01 0.32±0.02a 0.52±0.03ab 0.72±0.03abc 0.72±0.02abc 0.24±0.01abcde 365.914<0.01 N-cadherin蛋白0.63±0.03 0.48±0.02a 0.29±0.02ab 0.15±0.01abc 0.14±0.01abc 0.54±0.02abcde 338.530<0.01

3 討論

肝癌作為高發惡性腫瘤，嚴重威脅人類的健康［9］。肝癌的發生與乙型和丙型肝炎病毒感染、黃曲霉毒素、乙醇、肝硬化等有關［10］。但是，肝癌的發病機制仍不清楚。因此，研究肝癌發生的調控機制有助于開發新的治療方法。本研究觀察了買麻藤對人肝癌Huh-7 細胞增殖、遷移的影響。既往研究表明，買麻藤應用于抑制肝癌細胞的潛在路徑可能依賴買麻藤提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制作用［11］。買麻藤提取物對肝癌細胞具有顯著的抑制效果，表明了買麻藤的抗肝癌活性。然而，買麻藤在肝癌中的具體作用仍有待確定。與報道［3-4］相符，本研究進一步證明了買麻藤在肝癌中的作用，即20、40、60 ng/mL的買麻藤顯著降低了肝癌Huh-7 細胞的增殖、克隆形成能力和遷移能力，并導致細胞周期阻滯于G0+G1期，同時增殖、遷移相關蛋白 Ki-67、N-cadherin 和E-cadherin 的表達也受到顯著影響。重要的是，上述作用效果隨買麻藤濃度的增加而逐漸顯著，表明了買麻藤對肝癌腫瘤的抑制活性。

本研究還探討了買麻藤影響肝癌細胞增殖、遷移和周期的可能機制。發現20、40、60 ng/mL的買麻藤能夠顯著降低Huh-7 細胞中的LINC00673，且LINC00673 的表達隨買麻藤濃度的增加而降低，提示LINC00673 介導買麻藤的肝癌抑制作用。LINC00673 是位于染色體 17q24.3 上的 lncRNA 編碼基因，也是多種癌癥中的重要致癌基因［12］，已被確定與肝腫瘤的進展有關［13］。根據報道，LINC00673在神經膠質瘤細胞中高表達，LINC00673 沉默抑制神經膠質瘤U87MG 和U118MG 細胞的遷移和侵襲［14］。LINC00673 在乳腺癌組織中顯著上調，通過調節B7-H6和上皮—間質轉化促進乳腺癌的增殖和轉移［15］。LINC00673 通過 Kruppel 樣因子 2 誘導甲狀腺癌的增殖、轉移和上皮—間質轉化［16］。由此可見，LINC00673 起著癌基因的作用，促進肝癌［8］等癌癥的發生和發展。本實驗中，LINC00673過表達后，買麻藤抑制肝癌Huh-7細胞增殖、克隆形成、遷移、S期細胞比例、Ki-67、N-cadherin 表達的作用被逆轉，其促進G0+G1期細胞比例、E-cadherin 表達的作用同樣被逆轉。說明買麻藤抗肝癌增殖和遷移的作用機制與下調LINC00673表達有關。

綜上可見，買麻藤通過下調LINC00673的表達，抑制肝癌細胞增殖、遷移，并阻滯細胞周期，這為臨床實踐中肝癌的治療提供了潛在的選擇。