miR-138在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其對(duì)MHCC97H細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響

曾保征，王贛 ，陳超，黃遠(yuǎn)麗，董超

1 麻城市人民醫(yī)院，湖北麻城438300；2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院

肝細(xì)胞癌（HCC）是人類常見(jiàn)的原發(fā)惡性腫瘤之一，具有高侵襲性的特點(diǎn)，患者的5 年生存率低于10%，病死率居全球腫瘤的第三位［1］。雖然近年來(lái)外科手術(shù)和藥物治療取得了明顯的進(jìn)步，但HCC 患者的生存率仍沒(méi)有得到有效提高，患者預(yù)后仍然較差。HCC 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，研究顯示許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均參與其中，但目前具體機(jī)制尚不清楚，尚缺乏能夠有效抑制腫瘤的藥物［2］。研究顯示，具有高度保守性的miRNA 在機(jī)體眾多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，miRNA 能夠通過(guò)靶向調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展。據(jù)報(bào)道，miR-138 在惡性腫瘤生長(zhǎng)、耐藥、侵襲轉(zhuǎn)移、細(xì)胞自噬方面均發(fā)揮著重要的作用［3］。既往研究發(fā)現(xiàn)miR-138 在HCC 患者血清中表達(dá)明顯降低，但具體作用機(jī)制尚不清楚［4］。因此，本研究采用qRT-PCR檢測(cè)miR-138 在HCC 組織及細(xì)胞中的表達(dá)變化，并進(jìn)一步觀察其對(duì)HCC 細(xì)胞侵襲、遷移能力及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，為HCC 治療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料 收集 2016 年 7 月—2018 年 6 月在麻城市人民醫(yī)院行手術(shù)治療的60 例HCC 患者的癌組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本。60 例癌組織經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)均為HCC 組織，癌旁組織標(biāo)本均為無(wú)腫瘤細(xì)胞侵犯的正常組織。術(shù)前所有患者未進(jìn)行任何抗腫瘤治療。60 例患者中，＜50 歲 17 例，≥50 歲 43 例；男44 例，女 16 例；腫瘤直徑＜5 cm 23 例，≥5 cm 37 例；TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期 19 例，Ⅲ、Ⅳ期 41 例；Edmondson病理分級(jí)Ⅰ、Ⅱ級(jí)32 例，Ⅲ、Ⅳ級(jí)28 例；微血管侵犯26例，無(wú)微血管侵犯34例。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)備案批準(zhǔn)，所有患者及家屬對(duì)本研究知情同意。miRNA分離純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems 公司；所有引物購(gòu)自廣東銳博生物公司；TRIzol 試劑和Lipofectamine2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；Matrigel 膠購(gòu)自美國(guó) BD 公司；Tran?swell 小室購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司；miR-138 mimics及 NC-mimics 均購(gòu)自上海吉瑪公司；E-cadherin、Vi?mentin抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 高侵襲性人HCC 細(xì)胞系MHCC97H、低侵襲性人 HCC 細(xì)胞系 MHCC97L 和HepG2 以及正常人肝細(xì)胞系L02 均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，應(yīng)用RPMI1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 更換培養(yǎng)液1 次。轉(zhuǎn)染操作時(shí)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97H 細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞板，細(xì)胞分為miR-138 mimics 組 和 NC-mimics 組 ，分 別 應(yīng) 用 Lipo?fectamine2000 將 miR-138 mimics 及 NC-mimics 轉(zhuǎn) 染至MHCC97H 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h 更換為正常細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，取轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 miR-138檢測(cè) 采用qRT-PCR。應(yīng)用miRNA分離純化試劑盒提取HCC組織及癌旁組織、MHCC97H、MHCC97L、HepG2 及 L02 細(xì)胞的總 RNA，紫外分光度計(jì)測(cè)定濃度及純度。取1μg 總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，反應(yīng)條件：15 min 37 ℃，5 s 85 ℃。取 PCR 引物，以cDNA 為模板，按照 qRTPCR 反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書配置反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)，miR-138 引物序列上游：5"-GGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3"，下游：5"-AACTTCACAACACCAGCTTA-3"。U6引物序列上游：5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"，下游：5"-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。 qRT-PCR 反 應(yīng)條件：10 min 95 ℃；10 s 95 ℃，20 s 60 ℃，15 s 72 ℃，共進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)。采用 2-ΔΔCt計(jì)算 miR-138 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。取轉(zhuǎn)染后 24 h 的 miR-138 mimics 組和 NC-mimics 組MHCC97H細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞預(yù)先饑餓處理24 h后，接種于預(yù)鋪Matrigel膠的Transwell 小室上室內(nèi)（含2×105個(gè)細(xì)胞），Transwell 小室下室加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出小室，4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，0.1%的結(jié)晶紫溶液染色30 min，棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，PBS 清洗3 次，倒置晾干，高倍顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)，取平均值。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用劃痕實(shí)驗(yàn)。收集轉(zhuǎn)染 后 24 h 的 miR-138 mimics 組 和 NC-mimics 組MHCC97H 細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞板中，在37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至90%后，用200μL 微量移液槍頭在細(xì)胞板上垂直進(jìn)行“一”字劃痕，PBS 沖洗細(xì)胞2 次去除脫落的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的劃痕愈合情況，計(jì)算劃痕愈合率（%）。

1.6 E-cadherin、Vimentin 蛋白檢測(cè) 采用Western blotting 法。取轉(zhuǎn)染后 24 h 的 miR-138 mimics 組和NC-mimics 組MHCC97H 細(xì)胞，抽取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白樣品的濃度。每個(gè)樣本取得20μg總蛋白上樣，進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分離，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，PVDF膜以5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育過(guò)夜，分別加入E-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、β-action（1∶2 000）一抗，次日TBST 洗膜后，加入二抗后37 ℃孵育 1 h，TBST 洗膜后，ECL 顯影。應(yīng)用Quality One 分析條帶灰度值，以β-action作為內(nèi)參照，計(jì)算E-cadherin、Vimentin 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 組織及癌旁組織中miR-138 表達(dá)比較HCC 組織及癌旁組織中miR-138的相對(duì)表達(dá)量分別為0.41±0.09、1.08±0.06，兩者相比P<0.05。

2.2 HCC 組織中miR-138 的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 以60 例HCC 組織中miR-138 表達(dá)的均值為截?cái)嘀担瑢?0 例HCC 患者分為miR-138 高表達(dá)27 例和miR-138 低表達(dá)33 例。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示，miR-138 的表達(dá)與HCC 患者的微血管侵犯、TNM 分期密切相關(guān)（P 均<0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤直徑、Edmondson 分級(jí)、AFP 水平、HBV 感染等臨床病理特征無(wú)關(guān)，見(jiàn)表1。

表1 HCC組織中miR-138的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.3 HCC 細(xì)胞與正常肝細(xì)胞中miR-138 表達(dá)比較 HCC 細(xì)胞系 MHCC97H、MHCC97L 和 HepG2 中miR-138 的相對(duì)表達(dá)量分別為 0.26 ± 0.12、0.58 ±0.10、0.62 ± 0.11，均低于正常人肝細(xì)胞系 L02 中miR-138的相對(duì)表達(dá)量（1.02±0.04），P均<0.05，且MHCC97H 細(xì)胞中miR-138 的相對(duì)表達(dá)量低于MHCC97L 細(xì)胞和 HepG2 細(xì)胞（P均<0.05）。選擇miR-138 表達(dá)最低的MHCC97H 細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。

2.4 miR-138 對(duì)MHCC97H 細(xì)胞侵襲能力的影響miR-138 mimics 組、NC-mimics 組細(xì)胞劃痕愈合率分別為（86± 18）、（180± 21）個(gè)，兩組相比P<0.01。

2.5 miR-138 對(duì)MHCC97H 細(xì)胞遷移能力的影響miR-138 mimics 組、NC-mimics 組細(xì)胞中 miR-138的相對(duì)表達(dá)量分別為 1.01 ± 0.03、4.89 ± 0.27，兩組相比P<0.05。miR-138 mimics 組、NC-mimics 組細(xì)胞劃痕愈合率分別為（21.4 ± 2.6）%、（65.8 ±4.6）%，兩組相比P<0.01。

2.6 miR-138 對(duì) MHCC97H 細(xì) 胞 EMT 的 影 響miR-138 mimics 組 MHCC97H 細(xì) 胞 E-cadherin 蛋 白表達(dá)高于NC-mimics 組（P<0.05），Vimentin 蛋白表達(dá)低于NC-mimics組（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組MHCC97H細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 兩組MHCC97H細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

組別NC-mimics組miR-138 mimic組t P E-cadherin蛋白表達(dá)0.22±0.08 1.39±0.19 9.830 0.001 Vimentin蛋白表達(dá)1.89±0.23 0.79±0.15 6.939 0.002

3 討論

手術(shù)切除是目前治療HCC 的首選方案，但患者術(shù)后常較早出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致HCC 患者預(yù)后較差。HCC 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制尚未明確，尚缺乏有效的治療手段。近年來(lái)，隨著基因組學(xué)和蛋白組學(xué)的發(fā)展，惡性腫瘤侵襲進(jìn)展的分子生物學(xué)機(jī)制逐漸被發(fā)現(xiàn)，為阻斷惡性腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供了新的方向。

miRNA 是一類非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度21～24個(gè)堿基，通過(guò)調(diào)控下游靶基因的翻譯，在人體生命活動(dòng)中起著極其重要的作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的相關(guān)研究顯示miRNA 在惡性腫瘤的發(fā)生進(jìn)展、微環(huán)境改變、侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［5］。隨著研究的深入，在HCC 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)了許多起著重要調(diào)控作用的 miRNA。SUN 等［6］發(fā)現(xiàn)HCC 組織中miR-5692a 高表達(dá)，并且與臨床分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。WANG 等［7］報(bào)道，上調(diào)miR-200b 能明顯抑制HCC 細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。miR-212［8］、miR-539［9］、miR-371［10］等 miRNA 相繼被發(fā)現(xiàn)與HCC 發(fā)生進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。但至今尚未發(fā)現(xiàn)在HCC 發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用的miR?NA。miR-138 是新近發(fā)現(xiàn)的miRNA 家族重要成員之一，研究發(fā)現(xiàn) miR-138 在口腔鱗癌［11］、膽囊癌［12］、腎細(xì)胞癌［13］、非小細(xì)胞肺癌［14］等惡性腫瘤中異常低表達(dá)，扮演著“抑癌基因”的角色。目前有關(guān)miR-138 在HCC 中的研究甚少。本研究發(fā)現(xiàn)，HCC 組織中miR-138的表達(dá)低于癌旁組織，并且miR-138的表達(dá)與HCC 患者的微血管侵犯、TNM 分期關(guān)系密切。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HCC 細(xì)胞中miR-138 的表達(dá)低于正常肝細(xì)胞，并且高侵襲性MHCC97H 細(xì)胞中miR-138 的表達(dá)低于低侵襲性的MHCC97L 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞，提示 miR-138 可能參與了 HCC 的發(fā)生發(fā)展，可能與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

為了進(jìn)一步明確miR-138是否與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，本研究在體外實(shí)驗(yàn)中選擇高侵襲性MHCC97H 細(xì)胞做為后續(xù)研究對(duì)象，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染miR-138 mimics至MHCC97H細(xì)胞成功上調(diào)其miR-138 的表達(dá)，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)染后MHCC97H 細(xì)胞劃痕愈合率和穿膜細(xì)胞數(shù)明顯下降，提示上調(diào)miR-138 能夠明顯抑制MHCC97H 細(xì)胞的遷移和侵襲能力。EMT 是腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的重要啟動(dòng)環(huán)節(jié)［15-16］。EMT 發(fā)生時(shí)，上皮細(xì)胞源性標(biāo)志物E-cadherin 表達(dá)會(huì)顯著降低，而間質(zhì)細(xì)胞源性標(biāo)志物Vimentin 表達(dá)會(huì)顯著增加［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-138的MHCC97H細(xì)胞E-cadherin 蛋白表達(dá)升高，而Vimentin 蛋白表達(dá)降低，提示上調(diào)miR-138能夠明顯抑制MHCC97H細(xì)胞的EMT，從而對(duì)細(xì)胞的遷移和侵襲能力起明顯的抑制作用。

綜上所述，miR-138在HCC 中表達(dá)降低，并且與HCC 細(xì)胞的侵襲能力有關(guān)；上調(diào)miR-138 能夠抑制HCC細(xì)胞的EMT及侵襲遷移能力，這為HCC的治療提供了新的研究方向。