阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者血清miR-223、IL-18水平變化及臨床意義

高東艷 ，劉維英 ，董娜

1 蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州730000；2 蘭州大學(xué)第一醫(yī)院

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（OSAHS）是一種慢性缺氧性疾病，其主要由上呼吸道反復(fù)阻塞引發(fā)患者夜間間斷性缺氧和（或）睡眠呼吸暫停，導(dǎo)致患者精神萎靡、頭痛及注意力不集中，嚴(yán)重影響患者的神經(jīng)系統(tǒng)功能，還增加血流動(dòng)力學(xué)和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，已成為當(dāng)前重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］。OSAHS 患者睡眠呼吸障礙—反復(fù)缺氧的過(guò)程與缺血—再灌注損傷類似，啟動(dòng)過(guò)程中引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，并釋放白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等炎性介質(zhì)加速病情進(jìn)展［2］。血液中微小 RNA-223（miR-223）含量豐富，有研究證實(shí)其可降低循環(huán)血液中單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的活性，進(jìn)而抑制炎性因子的釋放［3］。白細(xì)胞介素18（IL-18）是機(jī)體炎性介質(zhì)之一，其可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞釋放干擾素及腫瘤壞死因子，進(jìn)而加重炎性損傷［4］。OSAHS 的發(fā)生、進(jìn)展與炎性反應(yīng)密切相關(guān)，miR-223、IL-18 可能參與其中，但具體機(jī)制尚不清楚。因此，本研究觀察了 OSAHS 患者血清 miR-223、IL-18 水平變化，并探討其臨床意義，以期為疾病的診療提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取 2018 年 11 月—2019 年 12 月于我院就診的OSAHS 患者80 例作為研究對(duì)象（OSAHS組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：OSAHS的診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)睡眠呼吸障礙組制定的《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南》中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［5］；年齡≥18 周歲；臨床資料完整，自愿進(jìn)入本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：近7天內(nèi)有急性呼吸系統(tǒng)感染病史；先天性肺發(fā)育不良；其他類型睡眠障礙性疾病；既往有耳鼻喉手術(shù)或氣道正壓治療史；嚴(yán)重的心、肺、肝、腎等重要器官功能障礙；惡性腫瘤、凝血功能障礙及免疫系統(tǒng)疾病。另選取同期門診體檢的健康者46例作為對(duì)照組（CON 組）。本研究已獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象簽署知情同意書。

1.2 相關(guān)資料收集 收集并記錄入組對(duì)象的基本資料，包括年齡、性別、BMI。使用Alice LE多導(dǎo)睡眠檢測(cè)儀（維康公司，美國(guó)）對(duì)所有入組對(duì)象進(jìn)行睡眠監(jiān)測(cè)（夜間21：00 至次日7：00），由專業(yè)睡眠呼吸科醫(yī)師對(duì)監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算讀取，包括：睡眠呼吸暫停低通氣指數(shù)（AHI）、夜間最低氧飽和度（LSpO2）、氧飽和度低于90%時(shí)間占睡眠時(shí)間百分比（Ts90%）。根據(jù)AHI 對(duì)OSAHS 患者進(jìn)行病情程度分級(jí)，AHI≤10次/小時(shí)為輕度、1020次/小時(shí)為重度。

1.3 血清miR-223、IL-18 檢測(cè) 采集OSAHS 組入院當(dāng)日、CON 組體檢當(dāng)日空腹靜脈血10 mL，以3 000 r/min 離心 15 min（離心半徑 14.5 cm），置于-80 ℃冷藏器中備用。①嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明，使用雙抗體酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中的IL-18，檢測(cè)試劑盒購(gòu)于BIM 公司（美國(guó)）。②使用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)血清中的miR-223。按照總miRNA 快速提取試劑盒操作說(shuō)明提取總miRNA；按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系操作說(shuō)明，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min、4 ℃保存；按照擴(kuò)增說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司（日本），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，miR-223 引物上游序列：5"-CAGAAAGCCCAATTC?CATCT-3"、下 游 序 列 ：5"-GGGCAAATGGATAC?CATCC-3"。以 U6RNA 為內(nèi)參，以 2-ΔΔCt法計(jì)算 miR-223 的相對(duì)表達(dá)量。③使用AU-5800 全自動(dòng)生化檢測(cè)儀（貝克庫(kù)爾曼特公司，美國(guó)）檢測(cè)其他生化指標(biāo)：HDL、TG、LDL、TC。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布使用±s表示，兩組比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較使用單因素方差分析，進(jìn)一步比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Logistic 回歸分析血清miR-223、IL-18 水平與OSAHS 的關(guān)系，使用受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)估血清miR-223、IL-18水平診斷OSAHS的價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組睡眠監(jiān)測(cè)通氣及血生化等指標(biāo)比較 OSAHS組男49例、女31例，年齡31～58（45.33±10.29）歲；CON組男30例、女16例，年齡32～60（43.64±9.27）歲；兩組年齡、性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OSAHS組BMI、AHI、Ts90%高于CON組，而LSpO2低于CON組（P均<0.05），詳見表1。

表1 兩組睡眠監(jiān)測(cè)通氣及血生化等指標(biāo)比較（±s）

表1 兩組睡眠監(jiān)測(cè)通氣及血生化等指標(biāo)比較（±s）

組別OSAHS組CON組t P n 80 46 BMI（kg/m2）25.35±4.67 21.12±2.69 2.965<0.01 AHI（次/小時(shí)）31.25±9.67 2.53±0.71 20.078<0.01 LSpO2（%）71.25±12.69 91.37±6.52 10.009<0.01 Ts90%（%）24.52±5.66 0.83±0.27 28.321<0.01 TG（mmol/L）1.34±0.38 1.26±0.25 1.277>0.05 TC（mmol/L）4.51±1.12 4.37±1.15 0.669>0.05 LDL（mmol/L）2.92±0.57 2.87±0.39 0.528>0.05 HDL（mmol/L）1.14±0.28 1.17±0.36 0.521>0.05

2.2 兩組血清miR-223、IL-18 水平比較 OSAHS組患者血清IL-18水平高于CON組，而miR-223水平低于CON組（P均<0.05），見表2。

表2 兩組血清miR-223、IL-18水平比較（±s）

表2 兩組血清miR-223、IL-18水平比較（±s）

組別OSAHS組CON組t P n 80 46 miR-223相對(duì)表達(dá)量0.54±0.16 1.51±0.43 18.151<0.01 IL-18（pg/mL）61.81±15.52 47.52±10.62 5.539<0.01

2.3 不同病情程度OSAHS 患者血清miR-223、IL-18 水平比較 OSAHS 患者病情程度為輕度23 例、中度41 例、重度16 例。隨著OSAHS 患者病情程度的加重，血清IL-18 水平逐漸升高，miR-223 水平逐漸降低（P均<0.05），詳見表3。

2.4 血清miR-223、IL-18水平與OSAHS的關(guān)系多因素 Logistic 回歸分析顯示，IL-18（OR=1.853）、AHI（OR=1.828）、BMI（OR=1.719）是 OSAHS 的危險(xiǎn)因素，miR-223（OR=0.569）是OSAHS 的保護(hù)因素（P均<0.05），詳見表4。

2.5 血 清 miR-223、IL-18 水 平 診斷 OSAHS 的 價(jià)值 miR-223、IL-18 診斷 OSAHS 的 ROC 曲線下面積（AUC）分別為 0.801、0.767，二者聯(lián)合診斷的AUC 為 0.861，高于 miR-223（Z=3.893，P<0.001）、IL-18（Z=4.052，P<0.001）任一單項(xiàng)指標(biāo)，詳見表5及圖1。

表4 血清miR-223、IL-18水平與OSAHS的關(guān)系

表3 不同病情程度OSAHS患者血清miR-223、IL-18水平比較（±s）

表3 不同病情程度OSAHS患者血清miR-223、IL-18水平比較（±s）

注：與輕度相比，aP<0.05；與中度相比，bP<0.05。

病情程度輕度中度重度F P n 23 41 16 miR-223相對(duì)表達(dá)量0.78±0.25 0.51±0.17a 0.26±0.08ab 112.298<0.01 IL-18（pg/mL）56.29±11.54 61.47±12.43a 70.59±14.51ab 18.521<0.01

表5 血清miR-223、IL-18水平診斷OSAHS的價(jià)值

圖1 miR-223、IL-18水平診斷OSAHS的ROC曲線

3 討論

OSAHS 患者長(zhǎng)期慢性間斷性缺氧，易引發(fā)機(jī)體交感神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度激活、胸腔壓力改變等，不僅導(dǎo)致患者的生活質(zhì)量下降，還會(huì)引發(fā)機(jī)體代謝紊亂，增加高血壓、心竭、腦卒中等心腦血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重威脅患者的生命健康［6］，因此其早期防治是臨床的工作重心。本研究發(fā)現(xiàn)OSAHS 患者的BMI、AHI、Ts90%升高，LSpO2降低，提示患者夜間氣道阻塞風(fēng)險(xiǎn)較高、缺氧嚴(yán)重，且可能與肥胖相關(guān)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)BMI、AHI是OSAHS發(fā)病的危險(xiǎn)因素，這也與既往的研究［7-8］相符。肥胖患者體內(nèi)脂肪沉積較多，呼吸道管壁結(jié)構(gòu)較厚，通氣受阻的風(fēng)險(xiǎn)增高［7］。AHI反映患者夜間氣道受阻程度，其值越大，患者病情越嚴(yán)重。臨床中對(duì)于肥胖患者，應(yīng)積極進(jìn)行夜間睡眠監(jiān)測(cè)并有效干預(yù)，以防疾病的發(fā)生進(jìn)展。目前，OSAHS 的早期預(yù)測(cè)缺乏有效的生物學(xué)指標(biāo)，且發(fā)病機(jī)制尚不明確，鑒于其發(fā)病與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，現(xiàn)階段炎癥相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)是研究熱點(diǎn)。

miRNA 是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA小分子，長(zhǎng)18～22個(gè)核苷酸，其可通過(guò)與非編碼區(qū)域的miRNA 調(diào)節(jié)元件結(jié)合，抑制靶mRNA 的翻譯進(jìn)而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，參與腫瘤、免疫炎癥、心腦血管等疾病的發(fā)生［9］。miR-223 是 miRNA 成員之一，位于性染色體的q12基因組中，其可調(diào)節(jié)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的活性，進(jìn)而調(diào)控炎性因子的釋放，參與機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)［10］。馮梅等［11］研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者血漿中的miR-223 是膿毒癥診斷的有效生物學(xué)指標(biāo)之一；郝曉煒等［12］研究證實(shí)，克羅恩病患者血清miR-223 的相對(duì)表達(dá)量與炎癥反應(yīng)狀態(tài)密切相關(guān)；李琳等［13］觀察到 OSAHS 患者外周血 miR-223 表達(dá)下降，且對(duì)患者病情程度具有較高的診斷價(jià)值；這些研究都提示miR-223 參與了機(jī)體多種炎性反應(yīng)過(guò)程。miR-223 與機(jī)體免疫系統(tǒng)—炎癥反應(yīng)及感染關(guān)系密切，一項(xiàng)基礎(chǔ)研究［14］發(fā)現(xiàn)，給予脂多糖刺激后的鼠巨核細(xì)胞中miR-223 表達(dá)受到明顯抑制，此抑制作用削弱了STAT3 介導(dǎo)的促炎作用。NLRP3 是miR-223 的靶基因之一，其可促進(jìn)炎性小體IL-1b 的釋放。有研究［15］顯示，EB 病毒中的 miR-223 可與NLRP3 碳端非編碼區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致炎性小體的產(chǎn)生。炎性小體是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的傳感器之一，其可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的過(guò)度反應(yīng)，加速組織損傷及炎性反應(yīng)。miR-223 通過(guò)抑制NLRP3 活性，進(jìn)而降低炎性小體的產(chǎn)生，發(fā)揮機(jī)體應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的變阻器作用［16］。據(jù)此，筆者推測(cè) miR-223 通過(guò)抑制 STAT3、NLRP3 信號(hào)通路活性，參與OSAHS、膿毒癥等炎性疾病的發(fā)生、進(jìn)展。

IL-18是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，其主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，是一種具有多向效應(yīng)性的促炎因子［17］。IL-18 主要與其受體 IL-18R 相結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。中性粒細(xì)胞表面含有豐富的IL-18R，其與IL-18 結(jié)合后形態(tài)發(fā)生改變，進(jìn)而被激活并定向游走至反應(yīng)部位，釋放蛋白水解酶、氧化代謝產(chǎn)物、花生四烯酸衍生物等一類列炎性物質(zhì)，加重機(jī)體局部炎性反應(yīng)，在發(fā)揮殺菌的同時(shí)，也損傷了正常細(xì)胞［18］。此外，IL-18 對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞具有一定的趨化激活作用，進(jìn)而導(dǎo)致組織高反應(yīng)性。IL-18 還可通過(guò)誘導(dǎo)AP-1、NF-κB及其他轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)IL-6、IL-8 等炎性因子的釋放，加重組織損傷［19］。近年來(lái)，IL-18 與動(dòng)脈粥樣硬化、OSAHS 等疾病的研究較多，但具體影響機(jī)制尚未闡明，本研究推測(cè)IL-18主要通過(guò)促進(jìn)機(jī)體各類炎性因子的表達(dá)參與其中。

本研究結(jié)果顯示，OSAHS 患者血清miR-223 水平降低，IL-18 水平升高，且二者皆隨患者病情嚴(yán)重程度的波動(dòng)而相應(yīng)降低或升高，說(shuō)明二者皆可較好反映患者病情進(jìn)展，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)OSAHS 的發(fā)生與miR-223 水平的降低和IL-18 的升高有關(guān)，這也與既往的研究相呼應(yīng)［13，18］。OSAHS 患者血清 miR-223水平降低，可能是其抑制STAT3、NLRP3信號(hào)通路活性，削弱機(jī)體炎性反應(yīng)，發(fā)生消耗性降低所致；而IL-18 水平越高，氣道炎性反應(yīng)越重，OSAHS 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)也越高。此外，miR-223、IL-18 診斷 OSAHS 的AUC 分別為 0.801、0.767，二者聯(lián)合診斷的 AUC 為0.861，高于任一單項(xiàng)指標(biāo)，這也進(jìn)一步證實(shí)miR-223和IL-18均可作為診斷OSAHS的可靠指標(biāo)，二者聯(lián)合檢測(cè)有利于患者的早期診斷，可指導(dǎo)臨床采取有效干預(yù)措施延緩疾病進(jìn)展。

綜上所述，OSAHS 患者血清IL-18 水平升高，miR-223 水平降低，且二者可較好地反映患者病情，聯(lián)合檢測(cè)可為疾病的早期識(shí)別提供幫助。