子宮內膜樣腺癌組織中差異表達miRNA篩選及其與患者預后高危因素的關系

馬成斌，劉平，劉彧，張文纓，王朝

上海市長寧區婦幼保健院，上海200051

子宮內膜癌（EC）是女性生殖系統常見的高惡性婦科腫瘤之一［1］。經統計分析，在我國大部分地區，EC 的發病率明顯高于宮頸癌，已成為女性生殖系統的主要癌癥［2］。盡管EC 的總體預后相對良好，但EC 發病率呈上升趨勢［3］。子宮內膜樣腺癌（EEC）占所有EC 病例的80%，主要采取手術聯合輔助放療、化療或激素治療，而對于晚期或復發的EEC患者，常規放療和化療效果不佳［4］。EEC 發生的分子機制非常復雜，涉及一系列基因和蛋白質的表達異常。近年來，國內外EEC 發病率均呈上升趨勢，其預后較差，預后的改善依賴于早期診斷。然而，EEC 的早期診斷困難，尚缺少高敏感性和特異性的腫瘤標志物。microRNA（miRNA）是真核生物中廣泛存在的由19～25個核苷酸組成的小分子非編碼單鏈RNA，目前研究已經發現超過50%的miRNA位于腫瘤相關基因組區域，對癌癥發生發展有重要的影響［5］。研究表明，在一些腫瘤組織中異常表達的miRNA 參與腫瘤的癌變過程，其作用類似于癌基因或抑癌基因，參與調控癌細胞增殖、凋亡、分化和遷移等重要生物學過程［6-7］。同樣，在 EEC 中，大量miRNA，如 hsa-miR-30c、hsa-miR-23a 以及 hsa-miR-199a-3p 已被報道通過調控多種信號通路和關鍵的靶點基因調控EEC 細胞的生長及遷移，從而影響EEC的癌變進程［8-11］。因此，初步篩選和鑒定EEC組織中顯著差異表達的miRNA，并分析其與患者預后高危因素的關系，對進一步研究miRNA 作為EEC 早期診斷和預后評估的分子標志物具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 氯仿和異丙醇購自上海化學試劑有限公司；miRNA 表達譜芯片購自美國Illumina公司；miRNA 芯片試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；Gene Pix 4000B 芯片掃描儀購自美國Axon公司；TRIzol 試劑購自日本 TaKaRa 公司；SuperscriptⅡreverse transcription 試劑盒購自美國Invitrogen 公司；SYBR Premix Ex Taq ⅡTM試劑盒購自日本TaKa?Ra 公司；PCR 擴增儀購自美國 BioRad 公司；EP 管購自德國Sarstedt公司；DEPC水購自北京索萊寶公司；低溫離心機購自德國Sigma公司。

1.2 樣本來源 收集本院2017 年7 月—2019 年7月手術的79 對EEC 患者冰凍癌組織和鄰近正常子宮內膜組織標本。所有患者在手術前未接受放療、化療和激素治療，并簽署知情同意書。標本采集獲得醫院倫理委員會審查批準。其中3 對樣品用于miRNA 表達譜芯片分析；17對樣品用于qRT-PCR 驗證芯片提示顯著變化的miRNA 表達；該標本來源的20 例患者的年齡為（53.8 ± 1.3）歲，FIGO 分期Ⅰa、Ⅰb 期，組織分化 G1、G2 級。其他 59 對樣品用于qRT-PCR 驗證下調最明顯的miRNA 的表達，標本來源的 59 例 ECC 患者≤60 歲 35 例（59.3%），>60 歲 24例（40.7%）；絕經前 10 例（16.9%），絕經后 46 例（77.9%）；手術病理分期Ⅰ期46 例（77.9%），Ⅱ期6例（10.2%），Ⅲ期7 例（11.9%）；組織分化G1 級23例（39.0%），G2 級 26 例（44.1%），G3 級 10 例（16.9%）；肌層浸潤深度≤1/2 47例（79.7%），肌層浸潤深度>1/2 12 例（20.3%）；有淋巴結轉移 7 例（11.9%），無淋巴結轉移52例（88.1%）；有脈管浸潤16例（27.1%），無脈管浸潤43例（72.9%）。

1.3 組織樣本RNA 提取 將新鮮的EEC 組織及相對應的鄰近正常子宮內膜組織浸沒于液氮中保存。進行樣本RNA 提取時，將組織樣本置于冰上研磨，并加入TRIzol 和氯仿。隨后，將研磨組織轉移至EP管中，于3 000 r/min 低溫離心10 min。離心結束后，將上清轉移至新的EP 管，同時加入等體積異丙醇。再次離心后棄去上清，獲得沉淀于EP 管底部的RNA。之后將1 mL 75%乙醇加入EP 管中，震蕩混勻，懸浮沉淀。待乙醇揮發晾干，利用DEPC 水溶解RNA 樣品，并利用生物分光光度計測定RNA 樣品濃度。

1.4 miRNA 差異表達譜分析 對提取的RNA 濃度及純度進行檢測，A260/A280在 1.8～2.1 被認為 RNA 純度符合實驗標準。隨后，利用離心過濾器分離10μg總RNA，并從中獲得miRNA。在HiSeq測序后，完成去除接頭和去除低質量和污染等過程，數據預處理獲得干凈序列。然后，統計序列長度的分布情況，以及樣品間公共序列。將預處理獲得的干凈序列進行分類和注釋，得到樣品表達信息后，利用剩余未注釋片段進行miRNA 的預測分析。隨后，采用Gene Pix 4000B 芯片掃描儀采集圖像，并利用配套分析軟件進行數據處理，最終篩選出差異表達的miRNA。相對于鄰近正常子宮內膜組織，將癌組織中miRNA 表達≥1.5 倍的定義為上調，<1.5 倍的定義為下調。

1.5 差異表達的miRNA 檢測 利用qRT-PCR對差異變化明顯的miRNA 芯片結果準確性進行進一步驗證。構建20 μL qRT-PCR 反應體系，其中包含 10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）、0.8 μL PCR Forward Primer（10 μmol）、0.8 μL PCR Reverse Primer（10 μmol）、0.4 μL ROX Ref?erence Dye Ⅱ（50×）、2 μL DNA 模板以及 6 μL ddH2O。將上述反應體系加入PCR 儀上，并按照95 ℃ 30 s、95 ℃ 3 s、61 ℃ 30 s循環40次的反應條件進行。U6 為內參基因，其引物序列U6 GSP（對應miRNA 的特異引物）為 5"-GCTTCGGCAGCA?CATATACTAAAAT-3"，R 為 5"-GTGCAGGGTCC?GAGGT-3"，退火溫度60 ℃，產物長度89 bp。另外，hsa-miR-369-3p 的引物 序列 hsa-miR-369-3p GSP 為5"-GGGCTGGGAGAGGGTTGTTT-3"，R 為 5"-GTG?CAGGGTCCGAGGT-3"，退火溫度 60 ℃，產物長度59 bp。采用2-ΔΔCt法計算miRNA的相對表達量。

1.6 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；miRNA 與患者預后高危因素之間的關系采用非參數檢驗方法分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EEC 組織中miRNA 基因芯片表達譜 聚類分析圖顯示冰凍EEC 組織與鄰近正常子宮內膜組織比較存在40 個差異表達的miRNA（圖1）。對miR?NA 表達譜芯片進行預處理和數據分析后，得到8 個具有代表性的差異表達的miRNA；5 個下調的miR?NA，分別為 hsa-miR-369-3p、hsa-miR-136-3p、hsamiR-451a、hsa-miR-493-5p 和 hsa-miR-543；3 個上調的 miRNA，分別為 hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-143-3p和 hsa-miR-145-5p。其中，hsa-miR-369-3p 下調最為明顯。見表1。

表1 EEC組織中8種顯著差異miRNA的表達

2.2 qRT-PCR驗證芯片篩選的異常變化的miRNA表達結果 與鄰近正常子宮內膜組織相比，EEC組織中hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-145-5p 表達差異倍數分別為6.50±0.09、2.70±0.16、5.60±0.22，表達上調；hsa-miR-369-3p、hsa-miR-136-3p、hsamiR-451a、hsa-miR-493-5p和hsa-miR-543表達差異倍數分別為 0.133 ± 0.012、0.268 ± 0.020、0.372 ±0.009、0.179±0.011、0.222±0.014，表達下調。qRTPCR驗證結果和miRNA測序結果一致。其中，hsa-miR-369-3p下調最明顯，被選為進一步研究的miRNA。

2.3 hsa-miR-369-3p表達與EEC患者預后高危因素的關系 EEC 組織中hsa-miR-369-3p 相對表達量為0.233 ± 0.175，較鄰近正常子宮內膜組織下降（P<0.05）。EEC組織中hsa-miR-369-3p的表達與手術病理分期、組織分化、淋巴結轉移、脈管浸潤有關（P均<0.05），見表2。

圖1 EEC組織中差異表達miRNA的聚類分析

表2 hsa-miR-369-3p的表達與EEC患者預后高危因素的關系（-x± s）

3 討論

EC是世界上最常見的婦科惡性腫瘤之一，近年來世界范圍內發病率有所增加，該病常見于絕經后婦女，但生育年齡女性亦可發生［12-14］。EC 的 5 年生存率與手術病理分期以及影響預后的高危因素息息相關。有數據表明，早期EC患者經過標準化治療后5 年生存率超過90%。相反，如果EC 發病程度達到Ⅲ、Ⅳ期，5 年生存率則降低為15%。常規的手術治療未能降低晚期EC的病死率［15］。EEC是EC中最為常見的類型，早期診斷仍是降低該病病死率的主要手段。但是，目前臨床仍缺少靈敏度高和特異性強的早期ECC 診斷及評估預后的分子標志物。因此，有必要研究新的生物學標志物來預防、早期診斷和評估ECC的進展。

人類基因組包含超過上千種miRNA，每種miR?NA可調節數百種轉錄物，總數約為所有基因的三分之一。這些miRNA 可以在不同腫瘤類型中上調或下調，發揮潛在腫瘤抑制劑或促進癌癥因子的作用［16-18］。目前，越來越多的研究發現，miRNA 表達譜在腫瘤發生發展過程中會發生異常，因而有望成為腫瘤早期診斷和預后判斷的分子標志物［19-20］。在EEC 研究領域，WU 等［21］使用 miRNA 表達譜分析 10對EEC 和鄰近的非腫瘤子宮內膜中miRNA 的表達譜，結果顯示，在EEC組織中，17種miRNA的表達高于非腫瘤樣本，6種miRNA 的表達低于非腫瘤樣本；其中，hsa-miR-205、hsa-miR-449 和 hsa-miR-429 在腺癌組織中顯著上調，而hsa-miR-204、hsa-miR-99b 和hsa-miR-193b 顯著下調。另外，DEVOR 等［22］利用microRNA 表達譜及 qRT-PCR 分析了 EEC 和漿液性腺癌中異常表達的miRNA，結果顯示，與正常子宮內膜相比，7 種miRNA 在EEC 和漿液性腺癌中低表達，13 種 miRNA 高表達；其中，miRNA 相對表達最低的為hsa-miR-133b，最高的為hsa-miR-205。本研究為進一步揭示EEC 中miRNA 表達譜的變化，使用基因芯片技術分析了3對冰凍EEC 組織和鄰近正常子宮內膜組織中miRNA 的表達譜改變。結果顯示，EEC 組織中有8 種miRNA 的表達發生了顯著變化，其中 5 種 miRNA 的表達下調，3 種 miRNA 的表達上調。經qRT-PCR 進一步驗證基因芯片結果發現，miRNA 表達譜改變結果一致，其中hsa-miR-369-3p下調最為明顯。本研究與前述研究結果相似，而且還發現了很多先前未報道的miRNA。該項研究豐富了 EEC 的 miRNA 差異表達譜系，為 miRNA 與EEC 癌變的關系提供了新的實驗依據。此外，本研究使用的基因芯片技術可以準確、快速定量檢測人類體內成熟的miRNA 的表達量，與傳統的Northern雜交等技術相比，該方法不需要接觸放射性同位素，且所需要的樣品量相對較少，檢測范圍廣［23-24］。

既往研究報道，hsa-miR-369-3p 參與調控多種人類疾病。在非腫瘤領域，一項miRNA 微陣列分析和miRNA-Seq 研究結果顯示，銀屑病患者血清和病變組織中hsa-miR-369-3p 的表達高于正常患者，而且hsa-miR-369-3p 表達和銀屑病疾病活動度呈正相關［25］。AGARWAL 等［26］研究提示，hsa-miR-369-3p上調通過靶向SOX4 抑制先天性巨結腸細胞的遷移和增殖。在腫瘤領域，有研究采用非洲綠猴腎細胞VERO 細胞株作為研究miRNA 的致瘤性作用的對象，發現多個miRNA 和VERO 細胞成瘤特征的發生相關，其中包括 hsa-miR-369-3p［27-28］。另有研究證實，hsa-miR-369-5p 可以作為肝細胞癌早期診斷的血清標志物［29］。在惡性膠質瘤患者中，hsa-miR-369-3p 的表達發生變化，這種變化與患者總生存率密切相關［30］。一項來自 LIU 等［31］的研究顯示，hsa-miR-369-3p 在EEC 中表達下調，并且通過自噬作用靶向ATG10 抑制細胞增殖和遷移。本研究發現，hsamiR-369-3p 在EEC 組織中的表達低于正常子宮內膜組織，該結果與LIU 等［31］研究一致。更重要的是，本研究發現，隨著手術病理分期增加、組織分化差、淋巴結轉移和脈管間隙浸潤，hsa-miR-369-3p 的表達下調。推測hsa-miR-369-3p 可能作為抑癌基因參與EEC 的發生、發展和轉移，有可能成為EEC 患者預后評價指標。

綜上所述，本研究利用芯片技術及qRT-PCR 技術篩選出EEC 中差異表達的miRNA，hsa-miR-369-3p在EEC 組織中表達下調最顯著，與EEC 患者預后高危因素密切相關。這些發現不僅有助于加深對EEC 發生發展機制的理解，同時也為hsa-miR-369-3p 作為EEC 候選生物標志物以及潛在基因治療方案提供了支持性證據。后續實驗將針對hsa-miR-369-3p在EEC中具體地調控作用進行進一步探究。