自組裝發光定量系統檢測膽囊癌患者血清循環游離DNA的水平變化及意義

朱李茹，華影，唐曉磊

1 湖北文理學院附屬襄陽中心醫院，湖北襄陽441021；2 皖南醫學院護理學院；3 皖南醫學院第二附屬醫院

膽囊癌（GBC）是膽道最常見的惡性腫瘤，膽結石是其主要危險因素［1-2］。由于早期缺乏典型的癥狀及體征，其5 年生存率僅為 5%～10%［3-4］。早期診斷和盡早治療對改善患者的生存至關重要。健康人循環游離DNA（cfDNA）主要由淋巴細胞和其他有核細胞凋亡后釋放入循環，而腫瘤患者體內cfDNA 主要由循環腫瘤細胞和腫瘤壞死裂解或活性釋放［5-7］，其水平可能隨著疾病的進展而變化，目前已經被報道與疾病的診斷和進展有關。cfDNA 檢測可作為一種非侵入性方法來檢測患病細胞和組織的遺傳物質，對區分癌癥患者和健康個人或其他各種非惡性疾病有重要意義。研究報道，多種腫瘤中cfDNA 的水平升高，如肺癌［8］、結腸癌［9］、宮頸癌［10］、卵巢癌［11］，乳腺癌［12］等，但 cfDNA 在 GBC 中的研究較少。目前對cfDNA 的檢測多基于qRT-PCR 法，其操作步驟繁瑣，耗時較長，易污染，且需要特殊儀器。而本研究設計的富鳥嘌呤（G）單鏈DNA探針具有特異性識別靶序列及自組裝特性雙重特性，其富G 序列與血晶素自組裝形成的G四聯體結構具有過氧化物酶催化活性，本研究利用該結構催化發光底物發光作為檢測信號，從而對探針識別的靶序列進行定量檢測［13-18］。本研究根據這一技術原理催化發光底物，并結合超敏光檢測的靈敏度進行優化，通過對管家基因含量的檢測進一步估算cfDNA含量。因此本研究采用這一發光系統對GBC 患者血清中的cfDNA進行檢測，并分析其與患者臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇 2017 年 2 月—2019 年 2 月湖北省襄陽中心醫院肝膽外科收治的83 例GBC 患者（GBC 組）、75 例膽囊炎患者（膽囊炎組），同時選擇體檢健康者70 例作為對照組。GBC 診斷依據2015年中華醫學會外科分會膽道外科學組頒布的《膽囊癌診斷和治療指南（2015 版）》。排除標準：有其他心肺基礎疾病；近期接受過創傷性治療。GBC 組男42例、女41例，年齡（65.53±17.25）歲，腫瘤分期Ⅱ期 15 例、Ⅲ期 21 例、Ⅳ期 47 例；腫瘤浸潤程度：T2、T3、T4分別為 14、26、43 例；局部淋巴結腫大：N0、N1、N2分別為 16、27、40 例；遠處轉移：M0、M1分別為 29、54 例；有黃疸 52 例。膽囊炎組男 42 例、女 33 例；年齡（62.59 ± 15.34）歲。對照組男35 例、女35 例，年齡（63.61±15.69）歲。三組性別、年齡比較差異無統計學意義。本研究經醫院倫理委員會批準，所有受檢者簽署了書面知情同意書。

1.2 血液樣本收集和DNA 提取 收集所有受試者外周血3.5 mL 于促凝真空管中。樣本凝固后，30 min內4 ℃ 10 000 r/min 離心15 min分離血清，置于-80 ℃冰箱中儲存。使用Serum DNA isolation Kit（Epigentek，USA）按照說明書提取血清中的DNA。

1.3 自組裝發光系統構建 選取人特異性β-actin DNA序列作為靶標：5"-ATGCCAACACAGTGCTGTCT?GGTGGTACCACCATGTACCCTGGCATT-3"（斜體加粗下劃線標記堿基為自組裝元件裝配預留空間位點）；設計自組裝發光系統識別ssDNA 探針，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，探針引物1：5"-TAGGGTTAGGGTTAGGGTCAGCACTGTGTTGGCAT-3"；探針 引物 2：5"-AATGCCAGGGTACATGGTGG?TACCACCAGTGGGAT-3"（下劃線部分為據所選靶標核酸序列設計的互補序列，斜體加粗序列為自組裝發光系統元件），其組裝及工作模式如圖1 所示。

圖1 自組裝發光系統模式圖

1.4 自組裝發光系統對cfDNA 的檢測 標準TaqMan人基因組DNA 的濃度為10 ng/μL，以此來制備 DNA 參考濃度 S1～S5，分別為 10、1、0.1、0.01、0.001、0 ng/μL。將設計的帶有自組裝元件的兩條引物（引物按照摩爾數1∶1 混合）以及血晶素（Sigma公司）充分混合后95 ℃加熱，緩慢冷卻至室溫，點樣于PVDF 膜（德國默克公司）上晾干，之后均勻噴灑發光底物（美國Lumigen 公司），立即放入化學發光成像儀成像（iBright CL750 型，賽默飛公司），根據光強度值和對應的標準核酸濃度擬合標準曲線。結果顯示該系統發光強度與cfDNA濃度對數存在正相關性（R2=0.658 7，P=0.004 4），見圖2。隨后，從血清中提取的cfDNA 的量通過同樣的方法檢測發光強度，利用軟件擬合量化cfDNA。

1.5 統計學方法 采用SAS8.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析；計數資料比較用χ2檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義

2 結果

2.1 三組血清cfDNA 水平比較 對照組、膽囊炎組 、GBC 組血清中 cfDNA 的水平分別為（82.94 ±47.51）、（198.66 ± 103.64）、（1 013.95 ± 681.96）ng/mL，三組間兩兩相比P均<0.01。

注：A 為自組裝發光系統成像圖，1～6 分別為 0、0.001、0.01、0.1、1、10 ng/μL 6 個濃度梯度的發光成像，每個濃度做 4 次重復檢測；B為光強度及對應標準濃度的相關性分析。

2.2 血清cfDNA 水平與GBC 患者臨床病理特征的關系 結果見表1。

3 討論

本研究利用單鏈核酸的自組裝發光技術檢測并評估了GBC 患者血清中cfDNA 的水平。將提取的DNA 與特異性的探針孵育后，利用核酸折疊與血晶素共同形成具有過氧化物酶活性的復合物，從而催化底物發光對核酸總量進行評估［13，19-20］。GBC 早期一般無癥狀，一般是在晚期通過USG、CT和（或）MRI得以診斷，且與慢性膽囊炎癥狀較為相似。然而，GBC的診斷和預后沒有特異性的腫瘤標志物。腫瘤標志物如腫瘤抗原（CA125、CA19-9、CA242、CA15-3）、癌胚抗原（CEA）等已廣泛用于肝癌、胃癌、結腸癌和胰腺癌的診斷［21-23］。單個的生物標記物通常顯示出相互矛盾的結果，而且其特異性較低。因此，有必要找到一個方法在早期階段診斷GBC。在此次研究中，我們評估了GBC患者血清中cfDNA的水平，并將健康者和膽囊炎患者作為對照進行比較。

研究發現，cfDNA 與各種疾病有著密切的關系。有研究分析，與健康對照相比，cfDNA 水平在其他的惡性腫瘤中是增加的，如在胃癌中高18 倍［24］。本研究表明，GBC 患者血清中cfDNA 的水平約是健康人的14倍，是膽囊炎患者的7倍。且本研究結果表明，GBC 患者血清中cfDNA 的水平與腫瘤分期、TNM 分及黃疸有關。UMETANI 等［25］發現癌癥病例中DNA的完整性與腫瘤的大小呈正相關關系，并且還與淋巴—血管侵襲以及淋巴結轉移有關。因此通過cfD?NA水平實現早癌的檢測是一種切實可行的方法［26］。

表1 血清cfDNA水平與GBC患者臨床病理特征的關系（±s）

表1 血清cfDNA水平與GBC患者臨床病理特征的關系（±s）

臨床病理特征年齡（歲）≤60>60性別男 女腫瘤分期Ⅱ、Ⅲ期Ⅳ期浸潤程度T2 T3 T4淋巴結腫大N0 N1 N2遠處轉移M0 M1黃疸無 有n 36 47 42 41 36 47 14 26 43 16 27 43 29 54 31 52 cf DNA（ng/mL）1 258.71±754.65 986.56±494.07 1 276.38±865.99 996.36±519.27 798.45±168.32 1 381.48±776.54 811.48±226.35 985.26±209.35 1 351.47±826.33 664.72±135.67 1 047.64±678.59 1 411.25±944.35 887.31±361.92 1 375.76±859.65 786.33±269.26 1 398.94±952.36 t/F 1.877 1.791 4.996 5.327 5.828 3.62 4.356 P>0.05>0.05<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

綜上所述，本研究利用游離富G 序列折疊形成G 四聯體的特性設計出單鏈DNA 探針，依據管家基因β-actin 作為標尺，通過發光系統的靈敏度對cfD?NA 進行定量，發現GBC 患者血清中cfDNA 水平高，且與腫瘤惡性程度有關。