AFP對(duì)正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞生物鐘基因表達(dá)的影響

何前進(jìn)，毛偉明，張喜華，岑紅兵，楊盛力，趙東明

1 黃岡市中心醫(yī)院，湖北黃岡438000；2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院；3 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院

越來(lái)越多的研究表明，甲胎蛋白（AFP）除了扮演肝癌診斷生物學(xué)標(biāo)志物的角色外，還和肝癌患者的惡性預(yù)后以及肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)［1-2］。AFP 可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，抑制肝癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，還介導(dǎo)了肝癌的化療耐藥［1-4］。近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)，生物鐘以及生物鐘基因的紊亂和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一些大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，倒夜班的人群更易患乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌［5-7］。且一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，生物鐘紊亂的負(fù)瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)更快［8-9］。甚至有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，改變細(xì)胞中生物鐘基因的表達(dá)可以改變細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力和對(duì)化療藥物的敏感性［10-11］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)AFP可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移，其還可以通過(guò)上調(diào)MDR1的表達(dá)引起肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素產(chǎn)生耐藥性［3-4］。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索AFP對(duì)正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞生物鐘基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗人AFP 單克隆抗體購(gòu)于Cell Sig?naling 公司，鼠抗人β-actin 單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz 公司，兔抗人 Cry1、Cry2、Clock、Bmal1、NPAS2多克隆抗體購(gòu)于Abcam 公司，鼠抗人Per1、Per2 和Per3 多克隆抗體購(gòu)于Novus 公司，胎牛血清購(gòu)于Hy?clone 公司，AFP 過(guò)表達(dá)的慢病毒載體購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，TRIzol、SYBR?Green PCR Master Mix、PCR 引物購(gòu)于Life公司，正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞和肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 細(xì)胞由武漢同濟(jì)醫(yī)院董漢華博士饋贈(zèng)。

1.2 構(gòu)建AFP 過(guò)表達(dá)細(xì)胞 ①細(xì)胞培養(yǎng)：將正常肝細(xì)胞L02 細(xì)胞和肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 細(xì)胞解凍后置于含10%FBS、100 U/mL 青霉素和100μg/mL鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中于 37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞培養(yǎng)融合至80%時(shí)，用0.25%胰酶消化后按照1∶3 進(jìn)行傳代。②細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組：取傳3 代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞和肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞，分別接種于6 孔板，每孔1×105個(gè)。隨機(jī)將正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞分為AFP過(guò)表達(dá)組1、AFP空轉(zhuǎn)組1，將肝癌細(xì)胞株SMMC-7721 細(xì)胞分為AFP 過(guò)表達(dá)組2、AFP 空轉(zhuǎn)組2，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。AFP 過(guò)表達(dá)組按10 MOI 加入AFP 過(guò)表達(dá)慢病毒和含聚凝胺的培養(yǎng)基，AFP 空轉(zhuǎn)組按10 MOI 加入AFP 空載體和含聚凝胺的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染12 h 后，吸棄含聚凝胺的上清液，加入新鮮培養(yǎng)基（含5%嘌呤霉素）繼續(xù)培養(yǎng)60 h。③轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證：采用real-time PCR 法。遵照TRIzol 使用說(shuō)明書提取各組細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA的濃度和純度后取2 μg 的mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR?Green PCR Master Mix（2×）說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行定量PCR 反應(yīng)，每個(gè)樣本設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)后將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 進(jìn)行10 倍稀釋做為模板。熒光定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：模板2 μL，10 μmol/L 的上游和下游引物各1 μL，SYBR?Green Mix 10μL，ddH2O 6μL，總反應(yīng)體系為20μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 1 min，94 ℃變性 60 s，56 ℃退火 45 s，72 ℃延伸45 s，共 33 個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min。以 β-actin 為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 AFP 相對(duì)表達(dá)量。所用引物序列見表1。

表1 PCR所用引物序列

1.3 AFP 對(duì)正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中生物鐘基因表達(dá)的影響

1.3.1 生物鐘基因mRNA 檢測(cè) 采用real-time PCR法，方法同1.2中③。

1.3.2 生物鐘基因蛋白檢測(cè) 采用Western blot?ting 法。裂解并提取細(xì)胞蛋白，通過(guò)BCA 法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行蛋白定量后在10%～12%的十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）上以每孔20μL蛋白上樣，進(jìn)行電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。分別加入鼠抗人Per1、Per2和Per3多克隆抗體（均1∶500 稀釋）；兔抗人NPAS2、Clock、Bmal1、Cry1、Cry2 多克隆抗體（均1∶400 稀釋）；兔抗人AFP 單克隆抗體（1∶300 稀釋）；鼠抗人β-actin 單克隆抗體（1∶2 500 稀釋）。分別加入HRP 標(biāo)記的兔抗鼠二抗、羊抗兔二抗（均1∶2 500稀釋）。化學(xué)發(fā)光法顯色，計(jì)算機(jī)掃描蛋白質(zhì)條帶后，采用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。將β-actin 作為內(nèi)參照，以生物鐘蛋白與β-actin 的比值代表該生物鐘蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

AFP mRNA 在 AFP 過(guò)表達(dá)組 1、AFP 空轉(zhuǎn)組 1 中的相對(duì)表達(dá)量分別為372.00±14.0、1.00±0.06，兩組相比P<0.05。AFP mRNA在AFP過(guò)表達(dá)組2、AFP空轉(zhuǎn)組2 中的相對(duì)表達(dá)量分別為492.67 ± 7.02、1.00 ± 0.06，兩組相比P<0.05。AFP 轉(zhuǎn)染對(duì) L02、SMMC-7721細(xì)胞生物鐘基因表達(dá)的影響見表1～4。

表1 AFP轉(zhuǎn)染對(duì)L02細(xì)胞生物鐘基因mRNA表達(dá)的影響（±s）

表1 AFP轉(zhuǎn)染對(duì)L02細(xì)胞生物鐘基因mRNA表達(dá)的影響（±s）

組別AFP空轉(zhuǎn)組1 AFP過(guò)表達(dá)組1 P生物鐘基因mRNA Clock 1.00±0.07 1.70±0.09<0.05 Bmal1 1.00±0.05 0.66±0.05<0.05 Per1 1.00±0.04 0.26±0.03<0.05 Per2 1.00±0.05 0.80±0.05<0.05 Per3 1.00±0.01 0.12±0.04<0.05 Cry1 1.00±0.05 1.00±0.09>0.05 Cry2 1.00±0.05 0.98±0.07>0.05 NPAS2 1.00±0.03 1.02±0.09>0.05

表2 AFP轉(zhuǎn)染對(duì)L02細(xì)胞生物鐘基因蛋白表達(dá)的影響（±s）

表2 AFP轉(zhuǎn)染對(duì)L02細(xì)胞生物鐘基因蛋白表達(dá)的影響（±s）

組別AFP空轉(zhuǎn)組1 AFP過(guò)表達(dá)組1 P生物鐘基因蛋白Clock 2.04±0.92 16.11±1.09<0.05 Bmal1 14.80±3.65 11.42±2.33<0.05 Per1 12.43±3.24 8.67±2.21<0.05 Per2 27.57±3.45 16.51±2.22<0.05 Per3 15.38±4.56 10.41±1.92<0.05 Cry1 8.33±1.32 9.48±1.24>0.05 Cry2 14.47±2.48 13.58±1.48>0.05 NPAS2 19.35±2.48 18.78±1.19>0.05

表3 AFP轉(zhuǎn)染對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生物鐘基因mRNA表達(dá)的影響（±s）

表3 AFP轉(zhuǎn)染對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生物鐘基因mRNA表達(dá)的影響（±s）

組別AFP空轉(zhuǎn)組2 AFP過(guò)表達(dá)組2 P生物鐘基因mRNA Clock 1.00±0.07 2.03±0.07<0.05 Bmal1 1.00±0.05 0.75±0.03<0.05 Per1 1.00±0.04 0.11±0.01<0.05 Per2 1.00±0.04 0.81±0.02<0.05 Per3 1.00±0.01 0.23±0.03<0.05 Cry1 1.00±0.05 0.83±0.07<0.05 Cry2 1.00±0.05 1.00±0.09>0.05 NPAS2 1.00±0.07 1.00±0.03>0.05

表4 AFP轉(zhuǎn)染對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生物鐘基因蛋白表達(dá)的影響（±s）

表4 AFP轉(zhuǎn)染對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生物鐘基因蛋白表達(dá)的影響（±s）

組別AFP空轉(zhuǎn)組2 AFP過(guò)表達(dá)組2 P生物鐘基因蛋白Clock 2.99±1.02 12.83±1.13<0.05 Bmal1 11.58±0.85 17.54±0.75<0.05 Per1 9.80±1.14 10.05±0.65<0.05 Per2 12.14±0.99 14.98±2.48<0.05 Per3 19.04±1.29 26.20±1.87<0.05 Cry1 4.64±1.07 6.16±1.23<0.05 Cry2 9.48±0.95 9.07±1.07>0.05 NPAS2 17.06±1.31 17.35±1.14>0.05

3 討論

AFP 是白蛋白家族中糖蛋白的一員，胎兒時(shí)期主要由胎兒肝細(xì)胞及卵黃囊合成，在成人血清中含量極低，但在肝癌患者的血清中卻明顯升高，因而在臨床上常被作為肝癌的診斷標(biāo)記物［1］。除了扮演肝癌診斷標(biāo)記物的角色外，AFP 還是一種具有多種功能的蛋白，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)AFP可以與肝癌細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，進(jìn)而激活Ca2+和 PI3/AKT 等信號(hào)通路，通過(guò)上調(diào) c-fos、Src、c-jun、Ras 等癌基因的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖［12-13］。此外AFP 還可通過(guò)抑制Caspase-3 的活性誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡［12-13］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)AFP 能夠上調(diào)肝癌細(xì)胞中的多藥耐藥基因MDR1 的表達(dá)，進(jìn)而引起肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素產(chǎn)生耐藥性［3］。本研究則發(fā)現(xiàn)AFP還可以引起正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中生物鐘基因的表達(dá)紊亂。主要表現(xiàn)為引起Clock 的表達(dá)上調(diào)和Bmal1、Per1、Per2、Per3 的表達(dá)下調(diào)。正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中生物鐘基因的變化趨勢(shì)基本一致，只是在Cry1 基因上略有差異，在L02 細(xì)胞中AFP 引起Cry1的表達(dá)下調(diào)，在SMMC-7721細(xì)胞中Cry1的表達(dá)無(wú)明顯變化。

生物鐘是自然界中的生命物質(zhì)在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中形成的與自然界同步的內(nèi)在生物節(jié)律。在分子水平上由Clock、Bmal1、Per1、Per2、Per3、Cry1和Cry2等基因共同調(diào)控［14-15］。調(diào)控方式為Clock和Bmal1形成異二聚體，結(jié)合到Per1、Per2、Per3 和Cry1、Cry2 基因的啟動(dòng)子上并激活其轉(zhuǎn)錄，表達(dá)產(chǎn)物Per1-3 和Cry1-2 蛋白又作為負(fù)性元件與Clock/Bmal1 結(jié)合并抑制其活性，進(jìn)而阻遏Per1-3 和Cry1-2 的進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄。因基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白入核需要一定時(shí)間，使得生物節(jié)律分子振蕩以近24 h 為周期自主進(jìn)行，生物鐘基因的這種反饋調(diào)節(jié)構(gòu)成了細(xì)胞內(nèi)精準(zhǔn)的內(nèi)源性“分子鐘”。長(zhǎng)期的晝夜和飲食不規(guī)律以及一些致癌因素可導(dǎo)致機(jī)體生物鐘紊亂，進(jìn)而引起下游鐘控基因表達(dá)異常，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［14-15］。

Clock基因是生物節(jié)律的必要調(diào)控者，在生物鐘體系中起著中心作用。Clock 在腫瘤組織中呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)，研究顯示Clock 過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移［14-15］。Bmal1則和Clock基因的功能相反，Bmal1 過(guò)表達(dá)可抑制腫瘤形成和增加腫瘤細(xì)胞化療藥物敏感性［14-15］。Per1、Per2 和 Per3 結(jié)構(gòu)和功能相似，均能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在腫瘤組織中普遍呈低表達(dá)狀態(tài)，被認(rèn)為是潛在的抑癌基因［14-15］。AFP 上調(diào)促癌基因 Clock，下調(diào)抑癌基因 Bmal1、Per1、Per2 和 Per3 的表達(dá)，正好和AFP 促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，抑制肝癌細(xì)胞凋亡的生物學(xué)行為相一致，也和臨床上AFP 高表達(dá)的患者較易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良的臨床現(xiàn)象相一致。

本研究的意義在于揭示了AFP 不僅是肝癌的診斷和預(yù)后標(biāo)記物，還是一個(gè)有生物學(xué)功能的蛋白。AFP可以引起正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中生物鐘基因的表達(dá)紊亂，進(jìn)而引起正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞內(nèi)生物節(jié)律紊亂，加速正常細(xì)胞的惡變和腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲遷移。在臨床上，對(duì)血清AFP 偏高的肝炎、肝癌患者均應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)和隨訪，警惕肝癌的發(fā)生和發(fā)展。另一方面，最新的研究顯示逆轉(zhuǎn)生物鐘紊亂可能是治療腫瘤的途徑之一［16］，能否通過(guò)抑制AFP的表達(dá)進(jìn)而逆轉(zhuǎn)正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞生物鐘紊亂達(dá)到控制肝癌的作用，還需要進(jìn)一步研究和探索。