肝細胞癌組織中miR-548c-3p、TRIM59的表達變化及其意義

熊香蕓 ，李茂山 ，彭雁忠

1 深圳市龍華區人民醫院，廣東深圳518109；2 廣州醫科大學；3 廣州金域醫學檢驗中心有限公司；4 北京大學深圳醫院

肝癌是成年人常見的癌癥之一，占中國惡性腫瘤發病率的五分之一［1］，2018 年全球新發肝癌病例84 萬例，肝癌死亡 78 萬例［2］。原發性肝癌中 75%～85%為肝細胞癌（HCC）［1］。導致 HCC 發生的主要病因有乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎的慢性感染，長期大量飲酒及各種原因導致的慢性肝硬化［2］。HCC 易出現肝內、外轉移，且術后復發率較高。盡管近期對HCC 分子機制的理解和治療方法取得了進展，但是目前仍迫切需要新的診斷或預后生物學標志物和治療靶點。miRNA 是指長度為19～25 個核苷酸的單鏈RNA 分子，不具有編碼蛋白能力［3］。近年來的研究證實，miRNA 在腫瘤的發生發展過程起重要作用。微小RNA 548c-3p（miR-548c-3p）是miR-548c家族中的一員，長度為22個核苷酸。miR-548c-3p 在骨肉瘤［4］、乳腺癌［5］中表達下調，過表達miR-548c-3p 可抑制骨肉瘤、乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力。三基序蛋白59（TRIM59）屬于三基序家族，該蛋白在卵巢癌、膽管細胞癌等組織和細胞中異常表達［6］。在卵巢癌相關的研究中，WANG 等［6］證實TRIM59 可以通過促進蛋白膜聯蛋白A2（ANXA2）的表達從而促進卵巢癌的進展。SHEN等［7］證實，TRIM59 可通過 PI3K/AKT/mTOR 信號通路抑制膽管細胞癌細胞的增殖能力。已有研究證實miR-548c-3p 可通過調控TRIM59 mRNA 表達促進HCC 細胞增殖和侵襲能力［8］，但仍未有兩者在HCC 組織中的表達情況及其與患者臨床病理特征及預后關系的研究。本研究分析了HCC 腫瘤組織中 miR-548c-3p、TRIM59 mRNA 的表達及意義，以期為尋找新的HCC 診治及預后的分子標志物提供方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2013 年1 月—2015 年1 月于深圳市龍華區人民醫院診治的114例行手術治療的HCC 患者的臨床病理資料。納入標準：經術后病理學檢查確診為HCC；初次發現，既往未接受過放化療等抗腫瘤治療；患者或其家屬均簽署知情同意書，術后病理及隨訪資料完整無缺。排除標準：既往患有其他惡性腫瘤；合并嚴重心肝腎等臟器功能不全；合并感染性疾病、自身免疫性疾病等。其中男75例，女39例；年齡23～78（60.1 ± 3.3）歲；腫瘤直徑≤5 cm者47例，>5 cm者67例；淋巴結轉移者49例；伴乙肝感染者56 例；伴肝硬化者43 例；腫瘤TNM 分期：Ⅰ期 39 例，Ⅱ期 40 例，Ⅲ期 35 例；分化程度：高分化32，中分化43 例，低分化39 例。以患者出院日為隨訪起始時間，利用電話隨訪，結合患者復查病歷。隨訪截止于2020 年1 月，隨訪間隔時間1個月。隨訪內容為隨訪期間患者生存情況。

1.2 組織中 miR-548c-3p、TRIM59 mRNA 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。收集術中切除的新鮮HCC 組織和距離4 cm 以上癌旁組織，經快速液氮冷凍運輸，于-80 ℃深低溫冰箱保存。將50 mg組織冰上研磨后按照TRIzol 說明書，提取組織RNA。按照逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，采用分光光度計鑒定cDNA純度，使A260/A280在1.8～2.0，置于-20 ℃冰箱儲存。TRIzol 試劑及逆轉錄試劑盒均購于Invitrogen公司。PCR 純化試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM購于TaKaRa公司。miR-548c-3p上游引物序列：5"-TGGT?GTCGTGGAGTCG-3"，下 游 引 物 序 列 ：5"-GGTG?CATTGTAGTTGCA-3"；TRIM59 mRNA 上游引物序列：5"-CTTCCGCCACTTGCCAATG-3"，下游引物序列：5"-TGGATCTCCCCTACTCGGTG-3"；內參基因 U6 上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCA-3′，下游引物序列5′-AACGCTTCACGA-3′；GAPDH 上游引物序列：5"-GAAGGTGAAGGTCGGAGTTC-3"，下游引物序列：5"-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3"。 反 應 體 系 ：SYBR mix 2.5μL、上游引物（10μmol/mL）0.1μL、下游引物（10 μmol/mL）0.1 μL、cDNA 1.00 μL、去核糖核酸酶水 1.3 μL。反應條件：95 ℃、30 s，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，42 個循環。以 2-ΔΔCt法計算 miR-548c-3p、TRIM59 mRNA 的相對表達量。每個實驗均重復3次以上。

1.3 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計量資料以±s表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗；采用Pearson 相關性分析分析miR-548c-3p 與TRIM59的關系；采用Kaplan-Meier法分析不同miR-548c-3p、TRIM59 表達患者的生存差異。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC組織與癌旁組織中miR-548c-3p、TRIM59表達比較 miR-548c-3p 在HCC 組織、癌旁組織中的 相 對 表 達 量 分 別 為 0.503 ± 0.141、0.890 ±0.076，兩者相比差異有統計學意義（t=25.796，P<0.05）。TRIM59 mRNA 在 HCC 組織、癌旁組織中的相對表達量分別為2.893 ± 0.329、1.203 ± 0.226，兩者相比差異有統計學意義（t=45.207，P<0.05）。Pearson 相關分析結果提示，HCC 組織中miR-548c-3p 表達與TRIM59 mRNA 表達呈負相關（r=-0.735，P<0.05）。

2.2 HCC 組織中 miR-548c-3p、TRIM59 mRNA 的表達與患者臨床病理特征的關系 HCC 組織中miR-548c-3p 及 TRIM59 mRNA 表達與 TNM 分期、淋巴結轉移和分化程度有關（P均<0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、是否患有乙肝及是否存在肝硬化無關（P均>0.05）。見表1。

表1 HCC組織中miR-548c-3p、TRIM59 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系（±s）

表1 HCC組織中miR-548c-3p、TRIM59 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系（±s）

臨床病理參數年齡<60歲≥60歲性別男 女腫瘤直徑≤5 cm>5 cm乙肝有 無淋巴結轉移有 無肝硬化有 無TNM分期Ι、Ⅱ期Ⅲ期分化程度高中分化低分化n 59 55 75 39 47 67 56 58 49 65 43 71 79 35 75 39 miR-548c-3p相對表達量（-x±s）0.512±0.140 0.493±0.172 0.525±0.139 0.483±0.143 0.494±0.145 0.506±0.134 0.517±0.146 0.492±0.141 0.107±0.148 1.028±0.132 0.471±0.148 0.506±0.165 0.535±0.146 0.431±0.132 0.551±0.166 0.411±0.113 t 0.649 1.516 0.455 0.930 35.002 1.140 3.610 4.724 P>0.05>0.05>0.05>0.05<0.01>0.05<0.01<0.01 TRIM59 mRNA相對表達量（-x±s）2.944±0.353 2.838±0.363 2.703±0.345 2.645±0.324 2.833±0.322 2.935±0.353 2.937±0.326 3.043±0.339 4.146±0.319 1.231±0.309 3.065±0.314 2.989±0.323 1.978±0.298 4.961±0.319 1.953±0.293 4.701±0.387 t 1.580 0.869 1.574 1.701 49.175 1.230 48.242 42.447 P>0.05>0.05>0.05>0.05<0.01>0.05<0.01<0.01

2.3 HCC 組織中 miR-548c-3p、TRIM59 mRNA 表達與患者生存預后的關系 本研究114 例HCC 患者中，隨訪2～60（38.2 ± 6.3）月，隨訪期間死亡79例，無失訪病例。以HCC 組織中miR-548c-3p mRNA 相對表達量均數0.503為臨界值，分為高表達56例、低表達 58 例。高 miR-548c-3p 表達者隨訪4～60 月，5年總體生存率（OS）為42.86%（24/56），生存時間為（38.5±6.7）月。低miR-548c-3p 表達者隨訪2～60月，5 年OS 為18.97%（11/58），生存時間為（29.1 ±5.9）月。Kaplan-Meier 分析（Log-rank 檢驗）表明，低miR-548c-3p 表 達 者 5 年 OS 低于高 miR-548c-3p 表達者（χ2=7.644，P<0.05）。低 miR-548c-3p 表達者生存時間低于高miR-548c-3p 表達者（t=7.957，P<0.05）。見圖1。

TRIM59 mRNA 相對表達量以均數2.893 為臨界值，分為高表達55 例和低表達59 例。低TRIM59表達者隨訪3～60 月，5 年OS 為 42.37%（25/59），生存時間為（42.1±6.2）月。高TRIM59 表達者隨訪2～60 月，5 年 OS 為 18.18%（10/55），生存時間為（31.1± 5.9）月。Kaplan-Meier 分析（Log-rank 檢驗）表明，低TRIM59表達者5年OS高于高TRIM59表達者（χ2=7.830，P<0.05），低TRIM59 表達者生存時間高 于 高 TRIM59 表 達 者（t=9.689，P<0.05）。見圖2。

3 討論

肝癌是我國成人最常見的癌癥之一，已經成為我國惡性腫瘤致死的重要因素之一［1-2］。肝癌轉移率高，術后復發率高。早期的肝癌因缺乏臨床癥狀，原發性肝癌在確診時，多數已處于中、晚期，可接受手術治療的患者為5%～10%［1］。盡管現在對HCC 的治療手段有所進展，如肝切除術、肝移植術、肝動脈栓塞化療等，但肝癌的5 年中位生存率仍保持在50%左右（17%～69%）［2］。到目前為止，關于肝癌轉移和復發的分子生物學機制仍然處于探索階段，因此探索肝癌進展過程的分子機制，合理利用生物標記物以評估復發和轉移的風險，將為進一步的治療提供方向和依據。

圖1 HCC組織中miR-548c-3p表達與患者生存預后的關系

圖2 HCC組織中TRIM59 mRNA表達與患者生存預后的關系

miRNA 是一種非編碼RNA，參與轉錄后調控下游基因的表達。miRNA 通過特異性結合靶基因mRNA 的3"非編碼區來調控下游多種基因的表達。miRNA 的表達和功能失常與炎癥、免疫及腫瘤等有關。研究表明，腫瘤中miRNA 異常表達影響腫瘤的增殖、遷移及浸潤等生物學行為，有可能成為腫瘤診斷、治療及隨訪的分子標志物［3］。miR-548家族最早發現可與多種病毒密切結合，如乙肝病毒、丙肝病毒和人類免疫缺陷病毒等，隨后的研究證實miR-548與多種腫瘤均有關系。近年來多項研究發現，miR-548c-3p可參與調節多種腫瘤的發生發展過程，通過調控下游不同基因的表達，發揮抑癌基因的作用［9］。例如miR-548c-3p 可通過抑制人低氧誘導因子1α（HIF-1α）介導的血管內皮生長因子（VEGF）信號通路抑制甲狀腺癌的進展［10］。本研究中，HCC 組織中miR-548c-3p的相對表達量顯著低于癌旁組織，其機制可能與調控miR-548c-3p 基因表達的長鏈非編碼RNA 表達異常有關。研究表明，長鏈非編碼RNA HIF1A-AS2 能夠作為分子海綿結合并抑制miR-548c-3p 的表達，激活 HIF-1α/VEGF 途徑，促進腫瘤細胞增殖、浸潤等惡性生物學行為［11］。另外，本研究結合患者的臨床病理特征數據發現HCC 組織中miR-548c-3p 的表達與TNM 分期、淋巴結轉移和分化程度有關，表明miR-548c-3p 參與促進肝癌的惡性進展。分析其原因，可能是miR-548c-3p 的表達下調激活VEGF的表達，VEGF能夠促進腫瘤的血管及淋巴管生成能力，導致腫瘤細胞通過血管或淋巴管發生轉移。此外，miR-548c-3p表達降低促進上皮間質轉化過程中的間質性表型的表達增加，如N-鈣黏素及波形蛋白的表達增加，促進腫瘤的惡性分化，導致腫瘤分化程度降低及分級增加［12］。Kaplan-Meier分析發現低miR-548c-3p 表達者5 年OS 低于高miR-548c-3p 表達者，進一步證明miR-548c-3p 的低表達可能與患者的預后不良相關，可作為HCC 患者不良預后的生物學標志。

TRIM 家族大多都擁有E3 泛素化連接酶活性，TRIM59 是TRIM 家族成員之一，其編碼基因位于3號染色體上，編碼的蛋白全長403個氨基酸，可通過調節p53 抑癌基因和AMP 依賴的蛋白激酶（AMPK）信號通路及原癌基因的轉錄激活，在腫瘤細胞代謝、增殖、轉移方面發揮重要作用［13-14］。本研究中，HCC組織中TRIM59 的mRNA 表達高于癌旁組織，其機制可能是，腫瘤微環境中轉化生長因子β 通過激活下游Smad2/3 信號的傳導，導致下游TRIM59 基因表達增加［15］。癌組織中TRIM59 mRNA 的表達與TNM分期、淋巴結轉移和分化程度有關，說明TRIM59 參與癌變進展。TRIM59 參與調節p53 和AMPK 的信號轉導能力，TRIM59 的表達上調可激活p53 和AMPK 信號通路，同時還可以促進原癌基因的激活，即從多途徑調節腫瘤細胞的增殖及轉移能力。CHEN 等［16］發 現 TRIM59 的表達可 激 活 Wnt/betacatenin 經典通路，促進腫瘤上皮間質轉化相關基因的表達，降低腫瘤分化程度，同時增強腫瘤細胞的增殖及轉移能力，使腫瘤易發生轉移。Kaplan-Meier分析發現高TRIM59 表達者5 年OS 低于低TRIM59表達者，結果提示TRIM59 可作為判斷HCC 預后的標志物。

Pearson 相關分析發現，HCC 組織中miR-548c-3p 與TRIM59 表達呈負相關，這可能是因為TRIM59是miR-548c-3p 的下游調控元件，即miR-548c-3p 可抑制TRIM59 的表達，從而抑制p53/AMPK 軸的促癌效應［8］。當癌組織 miR-548c-3p 的表達降低時，miR-548c-3p 無法促進 TRIM59 泛素化并導致 TRIM59 的降解能力下降，因此TRIM59 促進HCC 細胞的促增殖及遷移能力。

綜上所述，HCC 組織中miR-548c-3p 表達降低，TRIM59 mRNA 表達升高，兩者表達呈負相關，且miR-548c-3p、TRIM59 mRNA的表達與TNM分期、淋巴結轉移、分化程度和預后密切相關，二者有可能成為新的HCC診治及預后的分子標志物。