胃癌組織中miR-30a、FAP-α的表達變化及其臨床意義

馬秀麗，陳慶明，陳登榮，張潔民，劉偉昌，王精忠，李澤凱

1 武威市人民醫院，甘肅武威733000；2 遂寧市中醫院；3 蘭州大學第一醫院

2018 年全球胃癌的新發病例數為103 萬左右，占癌癥新發病例數的5.7%。胃癌死亡例數為78 萬左右，占比8.2%。目前胃癌的發生率排在惡性腫瘤第5 位，病死率排在第3 位，嚴重影響人們的生命健康［1］。早期胃癌的預后較好，并且治愈率較高［2］。而中晚期胃癌預后較差，容易發生遠端轉移和復發，導致患者的生存期縮短，因此提高早期胃癌的檢出率對于胃癌患者的治療以及預后改善尤為重要［3］。目前對于胃癌的發病機制仍然缺乏了解，已有的研究報道顯示在胃癌發病過程中多種微小RNA（miR?NA）表達量異常［4］。miRNA 是在細胞內廣泛存在的微小RNA 分子，通過堿基互補配對與基因的mRNA結合并促進其降解，從而導致基因表達水平下降［5］。微小RNA-30a（miR-30a）在細胞核和細胞質中均有分布，在卵巢癌和結直腸癌中表達下調，與腫瘤細胞的侵襲和遷移密切相關［6-7］。成纖維細胞活化蛋白-α（FAP-α）是一種膜蛋白分子，主要分布于細胞膜上，具有絲氨酸蛋白酶活性［8］。FAP-α 在乳腺癌和甲狀腺乳頭狀癌中表達上調，參與調節腫瘤細胞的侵襲遷移以及上皮—間質轉化等過程［9-10］。已有研究報道顯示，在肺成纖維細胞發育成熟過程中，miR-30a能夠負向調節FAP-α 表達，提示在機體內miR-30a與FAP-α表達存在相關性［11］。本研究通過檢測胃癌患者癌組織以及癌旁組織中的miR-30a、FAP-α，旨在探討其在胃癌組織中表達變化及其與胃癌患者臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇 2018 年 3 月—2020 年 2 月在武威市人民醫院治療的96例胃癌患者。納入標準：在入院之前未接受過放化療；不存在自身免疫性疾?。徊淮嬖诟腥拘约膊。唤洸±韺W診斷確診為胃癌。排除標準：存在嚴重肝腎功能障礙；不適宜進行胃癌根治術治療；合并有其他類型腫瘤；存在自身免疫性疾病。患者男 54 例，女 42 例；年齡 42～72（61.69 ±12.74）歲；其中 TNM 分期Ⅰ期 13 例，Ⅱ期 22 例，Ⅲ期 35 例，Ⅳ期 26 例；腫瘤直徑：≤3 cm 39 例，>3 cm 57 例；浸潤深度：黏膜層 49 例，黏膜下層 47 例；腫瘤分化程度：低、中、高分化分別為54、29、13 例；發生淋巴結轉移65 例。患者在入院后均行胃癌根治手術治療，收集手術過程中切除的患者腫瘤組織及相應的癌旁組織（距離腫瘤組織5 cm 以上）。本研究經醫院倫理委員會審核批準，所有患者知情同意。

1.2 組織中miR-30a 表達檢測 在胃癌組織及癌旁組織樣本中加入1 mL 的TRIzol 裂解液，室溫裂解30 min 后用于miR-30a 檢測。采用mirVana miRNA提取試劑盒（美國賽默飛世爾科技有限公司）提取組織中的總RNA。采用miRcute 增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司）對miRNA 進行逆轉錄。逆轉錄體系：5μL 總RNA，10 μL 逆轉錄緩沖液，2 μL 逆轉錄酶，3 μL 蒸餾水。逆轉錄條件：42 ℃，60 min；95 ℃，3 min。采用miR?cute 增強型miRNA 熒光定量檢測試劑盒對miR-30a進行熒光定量檢測。反應體系：10μL SYBR緩沖液，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，1μL cDNA，8μL蒸餾水。反應條件：94 ℃，20 s；50 ℃，30 s，35個循環。miR-30a 上游引物序列：5"-GTTGAGCTCTTGCTCCAGCC-3"，下游引物序列：5"-CGTGGATCAGTTTCCTG-3"；內參基因選擇U6，U6上游引物序列：5"-CTTCAATCA?GATAGCCAGCAT-3"，下游引物序列：5"-AGCCAGTTC?GTTGTGAGATAAC-3"。 采 用 2-ΔΔCt計 算 miR-30a 的相對表達量。

1.3 組織中FAP-α 表達檢測 手術過程中切除樣本后立即進行常規中性甲醛（上海德金科技有限公司）固定，梯度乙醇脫水后通過生物組織包埋機（美國倍安特醫療設備有限公司）進行常規石蠟包埋，制備成組織芯片。組織芯片脫蠟水化，使用3%過氧化氫（廣東恒健制藥有限公司）在37 ℃濕盒中孵育20 min，隨后在高壓鍋中進行抗原修復，封閉液37 ℃孵育30 min。孵育結束后滴加anti-FAP-α 抗體（Acam 生物科技有限公司）過夜。次日滴加二抗37 ℃孵育30 min，最后經二氨基聯苯胺（四川柯基圣科技有限公司）法顯色，蘇木精（上海恒景生物工程有限公司）復染、脫水、透明和固定，熒光倒置生物顯微鏡（德國德意克醫療器械有限公司）下觀察染色結果。細胞陽性數陽性比例≤5%為0 分，5%<陽性比例<25%為1 分，25%≤陽性比例<50%為2 分，50%≤陽性比例<75%為3 分，陽性比例≥75%為4 分。染色強度分為無色（0分），淡黃色（1分），棕黃色（2分）和棕褐色（3 分）。將陽性細胞數評分和染色強度評分乘積作為最終評分，分為陰性（0～4）和陽性（5～12）［12］。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；采用Spearman 相關性分析胃癌組織中miR-30a 和FAP-α 表達的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁組織中miR-30a、FAP-α 表達比較 胃癌組織中miR-30a 相對表達量為12.57 ±3.58，低于癌旁組織中的 20.99 ± 4.17（P<0.05）。96 例胃癌組織中FAP-α 陽性 80 例（83.33%），陰性16 例（16.67%）；96 例癌旁組織中FAP-α 陽性23 例（23.96%），陰性73例（76.04%）；兩者FAP-α陽性比例比較差異有統計學意義（P<0.01）。

2.2 胃癌組織中miR-30a、FAP-α 表達與患者臨床病理特征的關系 胃癌組織中miR-30a、FAP-α的表達與淋巴結轉移和 TNM 分期有關（P均<0.05），與年齡、性別、浸潤深度、腫瘤直徑和組織學分化無關（P>0.05）。見表1。

2.3 胃癌組織中miR-30a 和FAP-α 表達的相關性 胃癌組織中miR-30a 和FAP-α 的表達呈負相關（r=-0.872，P<0.05）。

3 討論

胃癌是臨床上較為常見的消化道惡性腫瘤，患者病死率較高，并且預后較差［13］。目前臨床上對胃癌的發病機制仍然缺乏了解，已有研究報道顯示腫瘤免疫逃逸、腸道微生物菌群失調、miRNA 調控紊亂以及促癌基因突變活化等因素均會造成胃癌的發生，其中miRNA 調控機制在胃癌診斷和治療中的臨床價值得到廣泛關注［14-15］。細胞內存在復雜的miR?NA 調控機制，單個miRNA 能夠同時調節多個基因mRNA 的轉錄和翻譯，并且不同的miRNA 之間也能夠結合并調節彼此之間的表達水平，在細胞分裂、分化、代謝和信號轉導等細胞活動過程中能夠發揮精細的調節作用［16］。因此，尋求與胃癌發生發展密切相關的miRNA 并將其應用于胃癌的診斷和治療中是今后胃癌研究的方向。

表1 胃癌組織中miR-30a、FAP-α的表達與患者臨床病理參數的關系

miR-30a 表達異常與腫瘤的發生發展密切相關。miR-30a 在肺癌和宮頸癌等腫瘤中表達下調，使得下游靶基因如MEF2D等促癌基因表達上調，促進腫瘤進展［17-18］。本研究發現，在胃癌組織中miR-30a 表達下調，并且其表達與淋巴結轉移和TNM 分期相關，表明miR-30a 在胃癌中可能起到抑癌基因的作用，并且與胃癌的惡性程度有關。分析其原因可能是由于miR-30a 參與調節腫瘤上皮—間質轉化以及胞外基質降解。已有研究發現Snail 基因是miR-30a的作用靶點，miR-30a與Snail基因mRNA 結合促使Snail的mRNA大量降解，從而導致Snail表達水平下調。Snail 是腫瘤相關轉錄因子，下游靶基因多參與腫瘤上皮—間質轉化，Snail 表達與腫瘤上皮—間質轉化和腫瘤轉移密切相關，Snail 表達水平下調會導致腫瘤細胞轉移和侵襲能力下降［19］。同時有研究發現miR-30a 能夠抑制無翅基因（Wnt）信號通路的活化。基質金屬蛋白酶2 和基質金屬蛋白酶9是Wnt 信號通路的下游靶基因，由于基質金屬蛋白酶具有蛋白酶活性，其能夠分泌至細胞外基質并催化胞外基質蛋白的降解［20］。因此胃癌中miR-30a 表達下調能夠促進Wnt 信號通路的活化，進而上調基質金屬蛋白酶2和基質金屬蛋白酶9的表達，使得胞外基質中膠原蛋白以及纖維蛋白等介導細胞間黏附蛋白被大量降解，引起胃癌細胞之間以及胃癌細胞與周圍正常組織細胞之間的黏附下降，胃癌細胞發生轉移而導致胃癌惡性程度較高。

FAP-α 是一種呈纖維細胞活化蛋白，本身具有絲氨酸/蘇氨酸磷酸化酶活性，能夠磷酸化修飾具有絲氨酸和蘇氨酸兩種氨基酸的蛋白質和多肽，參與調節細胞分裂、細胞骨架形成以及胞外基質分泌等過程［21］。已有研究表明FAP-α表達異常與腫瘤進展密切相關，在食管鱗狀細胞癌和胃癌等腫瘤中表達上調，能夠促進腫瘤細胞的增殖和遷移，進而促進腫瘤進展［22-23］。本研究發現在胃癌組織中FAP-α 陽性表達率明顯升高，并且其表達與淋巴結轉移和TNM分期相關，表明胃癌中FAP-α 表達也與胃癌的惡性程度相關。分析其原因可能是由于FAP-α參與腫瘤血管生成以及腫瘤免疫逃逸。CAO 等［24］研究發現，FAP-α 能夠激活絲氨酸—蘇氨酸激酶信號通路，進而促進腫瘤血管生成。腫瘤血管是腫瘤轉移的主要途徑，并且能夠為轉移的腫瘤細胞提供營養物質和氧氣以滿足腫瘤細胞增殖的需求。血管內皮生長因子是絲氨酸—蘇氨酸激酶信號通路的下游靶基因，腫瘤細胞通過向腫瘤微環境中釋放血管內皮生長因子以誘導腫瘤血管的生成［25］。因此胃癌中FAP-α表達上調能夠活化絲氨酸—蘇氨酸激酶信號通路，進而上調血管內皮生長因子表達并將其釋放至細胞外以誘導腫瘤血管生成，胃癌細胞進入腫瘤血管并實現轉移。同時，WEN 等［26］研究發現，FAP-α 能夠抑制機體的免疫功能。機體能夠通過細胞免疫和體液免疫兩個過程清除腫瘤細胞，機體免疫功能下降與腫瘤轉移和增殖關系密切。已有研究報道顯示，FAP-α能夠與T淋巴細胞表面的T細胞受體結合，進而抑制T淋巴細胞活化［27］。因此胃癌細胞膜表面分布大量的 FAP-α 蛋白，其與 T 淋巴細胞表面的T 細胞受體結合，進而抑制T細胞受體信號通路的活化，導致胃癌細胞發生轉移。

進一步研究結果顯示，胃癌組織中miR-30a 和FAP-α 表達呈負相關，分析其原因可能是由于兩者在胃癌中存在負調控機制。miRNA 主要通過與目標基因的mRNA 結合介導其降解，因此推測在胃癌中 miR-30a 可能能夠與 FAP-α 基因的 mRNA 結合并促進其降解，從而下調FAP-α 表達。由于胃癌中miR-30a 表達下調，因此 miR-30a 對 FAP-α 基因表達的抑制作用解除，從而導致胃癌組織中FAP-α 表達陽性率高。對于miR-30a 和FAP-α 之間的調控分子機制仍然需要后續研究進行深入探討。

綜上所述，胃癌組織中miR-30a表達下調，FAP-α陽性表達率升高，胃癌組織中二者表達呈負相關，并且均與腫瘤淋巴結轉移和TNM分期有關。