低溫脅迫下兩葉一心期棉花葉片的生理響應和轉錄組分析

王曉曼，王瓊珊，王孝剛，張教海，張友昌，張興中，別 墅，夏松波

（1.湖北省農業科學院經濟作物研究所，武漢 430064；2.農業農村部長江中游棉花生物學與遺傳育種重點實驗室，武漢 430064；3.湖北省農業科技創新中心，武漢 430064）

棉花是喜溫耐旱的作物，最適的生長溫度為28～30 ℃，溫度過高或者過低都會對棉花的生長發育及產量品質產生不利影響［1］。在春季天氣回暖的時候，會因冷空氣入侵，氣溫驟降，對作物造成損害，特別是倒春寒會導致爛苗和死苗現象。早期和晚期的倒春寒都會影響冬小麥的產量，早期倒春寒會使冬小麥產量下降19% 以上［2］。低溫脅迫會使棉花種子的發芽率、發芽勢、發芽指數都顯著降低，導致棉花減產［3］。

為了適應棉花產業發展的新特點，湖北省農業科學院改革傳統的植棉方式，選育推廣適合機采的棉花品種。以早熟、產量形成期一致、適宜直播密植品種為基礎，篩選出了適合機采的棉花品系CN01。CN01 屬于無限果枝類型，其株形松緊度適中，抗倒伏能力強，苗期長勢旺盛，結鈴能力強，吐絮暢，吐絮集中，生長期集中，適合機采。已在湖北省示范4年，機采產量達到3 955 kg∕hm2。

以棉花品系CN01 和抗寒性較強棉花品系SJB016 為材料，研究2 個棉花品系在低溫脅迫下不同的生理生化響應及轉錄調節機制，通過2 個棉花品系之間的差異表達分析，篩選與低溫脅迫響應相關的差異基因及代謝通路，對提高機采棉低溫抗性具有指導意義，為優化改良機采棉品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

CN01、SJB016 由湖北省農業科學院經濟作物研究所提供，均為適合機采的棉花品系。

1.2 材料處理

將棉花種子用濃硫酸脫絨。將要脫絨的棉花種子放在燒杯中，加入少量濃硫酸用玻璃棒攪拌脫絨3 min，將處理后種子放入網袋中用流水沖洗去硫酸。脫好絨的棉花種子在太陽下晾曬2～3 d，每天曬5～6 h。勤翻動，曬均勻，曬到種子搖動時有響聲。

兩葉一心期棉花培育：選取子粒飽滿的棉花種子，用規格為10 cm×10cm 的營養袋育苗。培養基質為營養土∶蛭石=3∶1，培養條件為25 ℃、RH75%、16h∕8h（晝∕夜）。

低溫脅迫對兩葉一心期棉花葉片影響試驗：2個溫度處理，25 ℃（CK）和12 ℃（低溫處理），7 個時間梯度（0、3、6、12、24、48、72 h），2 個重復，每個重復為6 株長勢一致良好棉花的混樣。取棉花幼苗的2片真葉為后續試驗材料，做好標記取樣。取樣后迅速放入液氮中，然后轉移到-80 ℃冰箱中保存。

1.3 試驗方法

參照蔡永萍［4］的方法，用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛的含量，用蒽酮-硫酸法測定可溶性糖的含量。用南京建成公司的試劑盒測定脯氨酸的含量。用天根試劑盒對棉花葉片的總RNA 進行提取，離心在室溫進行。RNA 反轉錄和熒光定量PCR參照文獻［4］。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對棉花葉片MDA 含量的影響

低溫脅迫對棉花葉片MDA 含量的影響見圖1、圖2。由圖1 可知，與對照相比，低溫處理過后的SJB016 中MDA 的含量呈現略微的上升，并在6 h差異達到最大，含量增加了24.82%。由圖2 可知，與對照相比，低溫處理過后的CN01 中MDA 的含量呈現先升后降的趨勢，并在6 h 差異達到最大，增加量為43.91%。低溫處理后CN01 和SJB016 的MDA含量均在6 h 達到最大差異，并且CN01 中MDA 含量的增加量要大于SJB016。

圖1 低溫脅迫對SJB016 棉葉MDA 含量的影響

圖2 低溫脅迫對CN01 棉葉MDA 含量的影響

2.2 低溫脅迫對棉葉可溶性糖含量的影響

低溫脅迫對棉葉可溶性糖含量的影響見圖3、圖4。由圖3 可見，正常情況下SJB016 棉葉中的可溶性糖含量維持在穩定的水平，低溫處理的前3 h可溶性糖含量與對照基本相同，當處理達到6 h 時可溶性糖含量出現了急劇增加的現象，與對照相比增加了65.29%。處理12 h 可溶性糖含量與對照相近，然后隨著時間增加低溫處理的可溶性糖含量呈增加的趨勢。由圖4 可見，正常情況下CN01 棉葉的可溶性糖含量維持在穩定的水平，但是低溫處理后，可溶性糖含量一直高于對照，在48 h 之后增長速率加快，6 h 可溶性糖含量增加了45.35%。

圖3 低溫脅迫對SJB016 棉葉可溶性糖含量的影響

圖4 低溫脅迫對CN01 棉葉可溶性糖含量的影響

2.3 低溫脅迫對棉葉脯氨酸含量的影響

低溫脅迫對棉葉脯氨酸含量的影響見圖5、圖6。由圖5 可見，3、6、12、24、48 和72 h 低溫處理的SJB016 棉葉中脯氨酸含量高于對照，其增加量分別為11.93%、6.36%、0.00%（0.000 23%）、6.43%、15.17% 和11.56%。從脯氨酸的含量變化可以看出，隨著低溫脅迫的時間延長，植物積累了更多的脯氨酸來應對變化。由圖6 可見，3、6、12、24、48 和72 h 低溫處理的CN01 棉葉中脯氨酸含量高于對照，其 增 加 量 分 別 為 2.1%、14.62%、17.23%、31.82%、31.48% 和57.49%。隨著低溫脅迫時間延長，CN01 受到的脅迫增加。

圖5 低溫脅迫對SJB016 棉葉脯氨酸含量的影響

圖6 低溫脅迫對CN01 棉葉脯氨酸含量的影響

2.4 轉錄組測序結果分析

從棉花葉片MDA、可溶性糖含量和脯氨酸的變化分析，低溫處理6 h 棉花葉片的生理指標變化較大，所以選取低溫處理6 h 的樣本開展轉錄組測序研究。

2.4.1 篩選差異表達基因 以padj<0.05 為標準篩選差異基因，差異基因數目和表達水平分布測定結果見圖7。對照與低溫處理的SJB016 差異基因總個數為6 815，其中上調的基因個數為3 990，下調的基因個數為2 825；對照與低溫處理的CN01 差異基因總個數為4 900，其中上調基因個數為3 547，下調基因個數為1 353；2 個棉花品系共有的差異基因總個數為3 288。受到低溫脅迫后，CN01 和SJB016共同差異表達的基因達到1∕2 以上，說明這些基因對低溫脅迫的響應在不同品系是保守的，特異性表達的基因決定了植物的耐冷性。

圖7 差異基因個數

2.4.2 差異轉錄因子分析 棉花對低溫脅迫的響應受多種基因協同調控，其中轉錄因子發揮了極其重要的作用。通過分析對照組與處理組的差異轉錄因子表達情況（圖8）發現，在CN01 中差異表達的轉錄因子為124 個，SJB016 中差異表達的轉錄因子為235 個，這些轉錄因子主要隸屬于25 個轉錄因子家族，差異基因集中分布在AP2-EREBP、bHIH、MYB、WRKY 等家族。在SJB016 中有更多的轉錄因子響應低溫脅迫，其中WPKY 家族在SJB016 中差異表達的基因為28 個，在CN01 中只有1 個。

2.4.3 差異基因功能注釋

1）GO 分析。對CN01 對照和處理的差異基因GO 注釋結果見圖9。差異基因注釋到3 241 個基因功能，富集功能為169 個，集中在生物學過程這一大類的為116 個功能，集中在分子功能這一大類的為48 個，集中在細胞組分這一大類的為5 個。分析挑選了富集最為顯著的30 個GO term 做了差異基因GO 富集柱狀圖。其中20 個屬于生物學過程，其中單一生物代謝過程（Single-organism metabolic pro?cess，GO：0044710）富集到的差異基因最多，共有891 個差異基因表達。有10 個屬于分子功能，其中分子內氧化還原酶活性（Intramolecular oxidoreduc?tase activity，GO：0016860）富集到的差異基因最多，共有22 個差異基因表達。

圖8 CN01 和SJB016 中差異表達轉錄因子家族基因比較

圖9 CN01 差異表達基因GO 功能分類統計

對SJB016 對照和處理的差異基因GO 注釋結果見圖10。差異基因注釋到3 434 個基因功能，富集功能為193 個，集中在生物學過程大類的為148個功能，集中在分子功能大類的為45 個。分析挑選了富集最為顯著的30 個GO term 做差異基因GO富集柱狀圖。其中21 個屬于生物學過程，其中生物學過程（Biological process，GO：0008150）富集到的差異基因最多，共有3 854 個差異基因表達。有9 個屬于分子功能。

圖10 SJB016 差異表達基因GO 功能分類統計

2）KEGG 分析。對CN01 對照和處理的差異基因KEGG 注釋結果見圖11。CCL 和LCL 差異基因共注釋到了122 個代謝通路。項目分析選取了富集最顯著的Pathway 做富集散點圖，富集通路為碳代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、晝夜節律—植物、磷酸戊糖途徑等。其中富集到代謝途徑的差異基因數最多。

圖11 CN01 差異表達基因KEGG 分類統計

對SJB016 對照和處理的差異基因KEGG 注釋結果見圖12。CSL 和LSL 差異基因的共注釋到了121 個代謝通路。選取富集最顯著的Pathway 做富集散點圖，富集通路為磷酸戊糖途徑、不飽和脂肪酸的生物合成、糖酵解∕糖異生、脂肪酸代謝等。其中富集到次生代謝物的生物合成的差異基因數最多。

圖12 SJB016 差異表達基因KEGG 分類統計

以CorrectedP-value<0.05 為指標，分析CN01和SJB016 中富集的代謝通路，發現碳代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、磷酸戊糖途徑、糖酵解∕糖異生、抗壞血酸和新陳代謝是2 個棉花品系共有的代謝通路，是2 個棉花品系響應低溫脅迫時保守的代謝途徑。與光合作用和植物激素相關的基因在CN01 和SJB016 中的表達有較大的差異。

3）與光合作用相關的差異基因分析。RNAseq 測序結果顯示差異基因主要分布在PSⅠ、PSⅡ、細胞色素b6∕f 復合物、光合電子傳遞和F 型ATPase。在CN01 中含有的差異基因個數分別為3、18、3、7、4，差異基因均表現為上調。在SJB016 中含有的差異基因個數分別為10、15、4、6、4。對比差異基因在CN01 和SJB016 中的分布，結果表明，共同的差異基因為PSⅡ上調（D2、cp43、PsbS、PsbZ）、PS Ⅰ上 調（PsaA）、細 胞 色 素b6∕f 復 合 物 上 調（PetC）、光合電子傳遞上調（FNR）、F 型ATPase 上調（β、b）。PsbP 和PsbQ 在CN01 中表達上升，在SJB016 中表達下降，呈現相反的表達，作為放氧復合物的組成成分，其表達變化呈現相反的趨勢，其對植物光合作用的影響應該在后續加以驗證。

4）與植物激素相關的差異基因分析。RNA-seq測序結果主要分析了生長素（IAA）、細胞分裂素（CTK）、赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）、乙烯（EY）、油菜素內酯、茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）8 種植物激素相關基因的差異表達情況。在CN01 中生長素相關的差異基因共有50 個，其中上調基因為47 個，下調基因為3 個。細胞分裂素相關的差異基因為2 個，均表現為上調。赤霉素相關的差異基因數為5 個，3個上調，2 個下調。脫落酸相關的差異基因為20個，19 個基因表現為上調。乙烯相關的差異基因為10 個，8 個基因表現為上調。油菜素內酯共有4 個差異基因，1 個下調。茉莉酸相關的差異基因為5個，1 個下調。水楊酸相關基因并無明顯差異。差異主要集中在生長素和脫落酸相關基因。SJB016生長素相關的差異基因共有61 個，其中上調基因為51 個，下調基因為10 個。細胞分裂素相關的差異基因為8 個，上調基因為5 個，下調基因為3 個。赤霉素相關的差異基因為6 個，5 個上調，1 個下調。脫落酸相關的差異基因為26 個，19 個基因表現為上調，7 個基因表現為下調。乙烯相關的差異基因為21 個，17 個表現為上調。油菜素內酯共有4 個差異基因。茉莉酸相關的差異基因為5 個，1 個下調。水楊酸相關基因并無明顯差異。

2.5 差異基因qRT-PCR 驗證結果

為驗證轉錄組測序結果的準確性，隨機選取了13 個差異表達的基因。這些基因功能分別為UDP-葡萄糖4-差向異構酶、GEPI48 原葉綠素依賴的易位子組分、赤霉素2-β-雙加氧酶、黃烷酮3-雙加氧酶蛋氨酸γ-裂解酶、阿魏酰CoA 鄰羥基化酶、酒精脫氫酶類、NAD（P）H-醌氧化還原酶亞基J、PSII CP43 反應中心蛋白、硫氧還原蛋白、NAD 依賴的蘋果酸酶59 kDa 同種型、細胞色素P450。將qPTPCR 檢測到的差異基因表達結果與轉錄組測序結果進行比較，發現二者結果呈現的基因差異表達相似（圖13、圖14），在CN01 和源23 兩個品系中的表達相關系數（R2）分別為0.874 4 和0.718 6，其Pvalue 值分別為0.692 9 和0.395 8，呈顯著相關。

圖13 CN01 實時熒光qRT-PCR 與轉錄組測序表達的比較

圖14 SJB016實時熒光qRT-PCR 與轉錄組測序表達的比較

3 小結與討論

3.1 低溫脅迫對棉花葉片膜脂過氧化的影響

在面對逆境損害時，植物體內有一系列的防御機制，其中SOD、POD、CAT、AsAPOD 等酶促防御系統中的重要組分在植物抗逆中發揮了不可替代的作用，但是MDA 含量的增加會對這些抗氧化酶活性產生影響［5］。將MDA 直接加到菠菜的無細胞提取物中可以減弱SOD、POD、CAT 的活性［6］。對比了CN01 和SJB016 棉花葉片在受到低溫脅迫時MDA含量的變化，發現與對照相比，MDA 含量呈先增加后減少的趨勢。低溫處理6 h CN01 和SJB016 的MDA 含量差異達到了最大，顯著性檢驗結果為極顯著。MDA 含量急劇上升，說明12 ℃的低溫對棉花葉片造成了損害，但隨著處理時間的增加，MDA 的含量逐漸下降，并逐漸與對照持平，說明當植物突然遭受到低溫脅迫時其體內的膜脂過氧化程度加深，但由于并不是極端低溫，隨著時間增加，植物體內的防御系統以及活性氧清除系統開始發揮作用，刺激植物體內一些抗寒基因的表達，從而增強了植物的抗寒性，植物體內的MDA 含量也開始降低，并與對照趨同。該研究結果與鄭國華等［5］研究低溫脅迫下枇杷葉片中MDA 含量的變化趨勢相同，7 ℃處理24 h 的枇杷葉中MDA 含量呈現先升高后降低的趨勢，但是-7 ℃處理24 h 的枇杷葉MDA 含量呈現增加的趨勢。

3.2 低溫脅迫對棉花葉片滲透調節物質含量的影響

低溫逆境下，植物體內常積累大量的可溶性糖，常見的有蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻多糖等。朱政等［7］研究低溫對茶樹葉片產生的影響，發現低溫脅迫時間越長，可溶性糖積累越多，在處理10 d 后可溶性糖呈現了翻倍的增長。矮牽牛H 株系低溫處理2 h，可溶性糖含量出現明顯的上升，此后其含量上升較少，但是一直高于對照［8］。

與對照相比，低溫處理的CN01 中可溶性糖含量一直呈現上升趨勢，在48 h 后上升速率增加，并且一直高于對照，這與低溫脅迫的茶樹葉和矮牽牛中可溶性糖的變化趨勢相同［7］。低溫處理的SJB016 可溶性糖含量在6 h 急劇上升，隨后下降，在24 h 與CN01 趨勢相同，出現了上升速率加快的趨勢。在試驗過程中，遭受低溫脅迫的棉花品系中可溶性糖含量高于對照，說明可溶性糖的積累對棉花抵抗低溫脅迫有著重要的作用。王孝宣等［9］對耐寒性不同的番茄幼苗受低溫脅迫時可溶性糖含量的變化進行了研究，發現低溫處理番茄品種的耐寒性與可溶性糖含量呈顯著正相關。

脯氨酸具有較高的溶解度，且無毒性，能夠降低細胞的冰點，防止細胞發生脫水死亡，是重要的抗寒調節物質［10］。在低溫逆境脅迫下，植物通過提高脯氨酸的含量來抵御外界環境的傷害。低溫脅迫時，不同的植物體內脯氨酸的變化并不完全相同，Yele?nosky［11］研究發現橘屬樹種面對低溫脅迫，脯氨酸含量變化不明顯。李育軍等［12］對大豆研究發現，脯氨酸的積累與抗冷性呈負相關。武輝［13］研究發現，受到低溫脅迫后，高耐寒棉花品種比冷敏感棉花品種積累了更多的脯氨酸。

低溫處理后CN01 和SJB016 中脯氨酸含量均高于對照，CN01 的的脯氨酸增加量要高于SJB016，該結果顯示發芽試驗得出的SJB016 的耐寒性高于CN01 與武輝等人研究的低溫脅迫后耐寒品種有更多的脯氨酸積累結果相違背，猜測原因可能：一是低溫脅迫對棉花發芽率的影響和對兩葉一心期棉花的影響并不是完全同步的；二是棉花耐寒性的鑒定需要多個指標綜合考慮，一個指標與前人研究不符不能完全代表該品種耐寒性差。

3.3 低溫脅迫對棉花葉片光反應系統的影響

低溫對植物光合作用的影響巨大，幾乎可以影響參與光合作用所有主要組分正常功能的行使，包括電子傳遞，卡爾文循環以及氣孔的開放程度等［14］。相比較PSⅠ系統來說，PSⅡ發生光抑制的現象更為常見。低溫脅迫會導致PSⅡ反應中心失活，從而影響光能的吸收，造成PSⅡ的光抑制［15］。植物為了應對逆境造成PSⅡ系統損傷對植物光合作用產生影響，損傷和修復同時進行，其中起關鍵作用的就是D1 蛋白的快速周轉［16］，損傷和修復的相對速率直接決定了PSⅡ的光抑制程度。

低溫脅迫下CN01 和SJB016 光合相關基因表達發生了變化，在CN01 中PSⅡ復合物的外在蛋白PsbQ 表達上調，而在SJB016 中該基因的表達下調。有研究報道，PsbQ 的存在對PSⅡ放氧中心的結構和功能有重要的影響［17］，PsbQ 參與的PSⅡ復合物是藍細菌PSⅡ的最佳功能形式。安飛飛等［18］發現低溫脅迫使木薯葉片中PAⅡ系統中的放氧復合體的表達水平下降。Chen 等［19］發現高溫脅迫3 h，小麥中PSⅡ發生了快速強烈反應，PsbQ 顯著降低。從上述研究可見逆境脅迫會導致PsbQ 表達下降。

3.4 植物生長調節劑與低溫脅迫的關系

植物生長調節劑在植物體內的含量很少，但對調節植物的生長發育有著重要的作用，對植物的抗寒性也有重要的作用。

岳丹等［20］發現赤霉素含量降低、脫落酸的含量升高，可以提高杏樹的抗寒性，隨著抗寒性的增強，ABA∕GA3的比值也上升，這與Rikin 等［21］的研究相似。植物的抗寒性與ABA∕GA3的值呈現正相關，主要是由于ABA 含量升高使得比值升高。試驗測序結果顯示，與ABA 相關的差異基因表達大部分表現為上調，說明為了應對低溫脅迫，CN01 和SJB016都增加了ABA 的基因表達。

Yuan 等［22］發現低溫脅迫會使得草果幼苗中生長素含量降低，生長素酰胺合成酶的編碼基因GH3的表達量明顯升高，GH3的表達會減少游離的生長素。Du 等［23］發現低溫處理水稻，游離生長素（IAA）含量增加，與生長素合成的相關基因表達上調，GH3蛋白的編碼基因發生下調。本研究測序結果顯示，大量的與生長素相關的差異基因在低溫處理的CN01 和SJB016 中表達，大部分基因表現為上調，也有部分基因表現為下調。具體的基因表達與生長素以及棉花抗冷性的影響需要后續試驗驗證。

Shi 等［24］發現，擬南芥遭受低溫脅迫，體內生長素含量會明顯降低，乙烯過量生成的突變體擬南芥表現出低溫敏感，而施加了乙烯抑制劑的擬南芥表現出低溫抵抗力增強。

3.5 轉錄因子對低溫脅迫的響應

在遭受低溫脅迫時，植物體內的轉錄因子會發生響應改變，提高植物在低溫脅迫下的生存率。本研究發現，低溫處理過后CN01 和SJB016 的差異表達轉錄因子主要集中在AP2-EREBP、bHLH、MYB以及WRKY 等轉錄因子家族，且差異表達基因均處于下調狀態。

Chen 等［25］發現低溫脅迫使得花生中AhERF4的表達量明顯升高。辣椒中的轉錄因子CaPF1 在東部白松中過表達可以提高東部白松的耐冷性［26］。本研究中AP2-EREBP 家族轉錄因子下調，可能是通過負反饋調節機制來提高棉花對低溫脅迫的耐性。

植物的MYB 轉錄因子與植物體內多種生物過程息息相關，MYB 轉錄因子表達的變化能夠調控多種生物學過程，幫助植物正常生長發育。劉曉月等［27］發現，耐低溫水稻中MYB基因在多個時間點上調，在低溫敏感的植物中，MYB基因表達模式較多，說明植物可以通過調節MYB基因的表達模式來提高自身對低溫逆境的適應性。本研究發現，低溫處理CN01 和SJB016，MYB 家族轉錄因子表達有明顯的差異，SJB016 下調的差異基因要多于CN01。說明MYB基因下調能夠提高CN01 和SJB016 對低溫的耐受性。

WRKY 是植物中較大的轉錄因子家族，參與的生物學過程多種多樣。受到低溫脅迫的楊樹，有1∕2 以上的WRKY 家族轉錄因子表達會發生變化［28］。AtWRKY34能夠負調控CBF 介導的低溫應答途徑［29］。本研究發現，低溫脅迫處理后，WRKY基因在CN01 和SJB016 中均出現顯著下調的現象，但在SJB016 中差異表達了更多的基因，這應該與不同棉花品系對低溫脅迫的耐受性不同有關。