真菌NBERC_51984中次生代謝產物的分離純化及除草活性研究

吳兆圓，張志剛，張亞妮，劉 芳，方 偉

（湖北省生物農藥工程研究中心，武漢 430064）

利用自然界生物中具有生物活性的代謝產物開發新的生物源除草劑是生物除草劑研發的一個重要途徑和未來發展方向。這類化合物具有化學結構新異，作用靶點獨特，廣譜、低毒、低殘留、受環境影響較小等特點，而源于真菌的活性產物最多，目前已經發現了7 萬多種［1］。如從多節孢屬真菌Nodulispori?umsp. A21 中得到的化合物Deoxysporothric acid 和Epideoxysporothric acid，50～200 μg∕mL 時能顯著抑制雙子葉雜草鱧腸（Eclipta prostrata）和阿拉伯婆婆納（Veronica persica）的生長［2］。旋孢腔菌屬真菌Co?chliobolus australiensis是從雜草水牛草（Cenchrus cil?iaris）中分離得到的病原真菌，其產生的次生代謝物Cochliotoxin 相對于原生草，選擇性地對水牛草產生植物毒性，可以作為水牛草的天然除草劑［3］。由鐮刀菌屬真菌FusariumDA056446 和炭豆菌屬真菌RoselliniaDA092917 產生的次生代謝物Mevalocid?in，除草譜廣，苗后除草作用大于苗前，而且除草作用起效慢，雜草呈現的狀態與已知的商用除草劑處理后的狀態均不同，很可能為新的除草機制，并且能在韌皮部移動，具有開發前景［4］。由鏈格孢屬真菌Alternaria alternata產生的細交鏈格孢菌酮酸（Tenu?azonic acid，TeA）也是廣譜除草劑，且是入侵雜草紫莖澤蘭（Ageratina adenophora）褐斑病的主要致病因子。研究表明，TeA 是一種天然的光系統II 抑制劑，并且田間試驗表明有機合成的TeA 能有效控制棉花田的2 種重要雜草馬唐（Digitaria sanguinalis）和反枝莧（Amaranthus retroflexus），但對棉花無影響［5］。這些化學結構豐富和生物活性多樣性的真菌次生代謝產物為開發新的除草劑提供了絕佳的機會。

本研究在微生物源農藥活性代謝產物的篩選過程中，得到1 株具除草活性的真菌NBERC_51984，經過活性追蹤、大量發酵、提取、從活性部位分離純化得到了2 個化合物（圖1），經LC-MS 和1D、2DNMR 鑒定為Pseurotin A（1）和Bisdethiobis（methyl?thio）gliotoxin（2），并對其除草活性進行了進一步測試。

1 材料與方法

1.1 儀器和主要試劑

Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振儀（TMS為內標，δ 為10-6，J 為Hz）、Bruker APEX DUO 單晶衍射儀（銅靶衍射）（德國Bruker BioSpin 公司）；Wa?ters 2695 液質聯用儀（美國Waters 公司）；Waters 2767 高效液相制備儀（Waters 2525 泵，帶2767 自動收集系統，2996 二級管陣列檢測器，色譜工作站Masslynx V4.0）；美國Sunfire C18OBD 制備柱（5 μm，19 mm×250 mm∕10 mm×250 mm）；100～200 目柱色譜填料柱層析硅膠（青島海洋化工廠）。分離提取用試劑乙酸乙酯和乙腈均為國藥集團生產。

1.2 微生物

菌株分離于吉林省長白山巖石火山土（2016年9月采樣），現菌種保存在湖北省生物農藥工程研究中心，編號NBERC_51984。

1.3 菌株的培養和提取

NBERC_51984 發酵培養基：麥芽糖6.25 g∕L，麥芽 提 取 物6.25 g∕L，酵 母 提 取 物1.0 g∕L，蛋 白 胨0.625 g∕L，磷酸二氫鉀1.25 g∕L，硫酸鎂0.625 g∕L，pH 調至7.0，加入0.3%瓊脂，于28 ℃靜置培養7 d。

初篩時發酵液50 mL，冷凍干燥后，加入等量乙酸乙酯提取，離心，取上層有機相，回收乙酸乙酯后加入1 mL 甲醇溶解，作為活性跟蹤半制備樣品。大量發酵5 L 的發酵液中加入5 L 的乙酸乙酯攪拌提取3 次，提取液過濾后真空濃縮得到提取物0.75 g。

1.4 活性跟蹤和分離純化

活性跟蹤取800 μL 初篩樣品進行半制備（Sun?fire C18OBD 半制備柱，5 μm，10 mm×250 mm，7.5 mL∕min），洗脫梯度為5%～100% 乙腈，洗脫40 min，得到36 個組分，溶劑蒸發后作為活性測試樣品。

大量發酵的乙酸乙酯提取物用少量甲醇溶解，經硅膠柱色譜進行柱層析，用石油醚∕乙酸乙酯進行梯度洗脫，洗脫組分通過HPLC 檢測合并為10 段（Fr.1～Fr.10）。活性組分Fr.8（35.2 mg）經制備色譜柱（Sunfire C18OBD 制備柱，5 μm，19 mm×250 mm，24 mL∕min）進行分離，洗脫梯度為5%～100% 乙腈，洗脫40 min，得到化合物1（7.89 mg）和化合物2（2.86 mg）。

1.5 除草活性測試

反枝莧、脫殼狗牙根種子經除菌處理后以無菌水反復振蕩、浸洗5 次以上，移除積水，種子攤開置于無菌操作臺中吹干，備用。

把經過高壓滅菌后的水瓊脂加入96 孔組織培養板（深孔），冷卻后備用。把準備好的反枝莧、狗牙根種子分別轉接到瓊脂表面，接入種子量以單層種子全部覆蓋水瓊脂表面為準。將活性跟蹤組分樣品加入5 mL 無菌水后取20 μL 作為生測樣品，空白對照為0.1% 吐溫-80 的無菌水，重復3 次［6，7］。培養條件為：溫度20 ℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照度8 000 lx。從第5 天開始檢查并記錄活性，根據除草活性反應的不同，使用分級指標數（0、3、5、7、9）標記除草活性，0 表示沒有除草活性，株高與空白對照一致，3、5、7 表示株高分別為空白對照的70%、50% 以及30%，除草活性依次增強，9 表示除草活性最強，種子沒有發芽。

化合物和陽性對照樣品用乙醇配置成10 mg∕mL濃度溶液，然后加入含0.1% 吐溫-80 的無菌水依次稀釋至100 μg∕mL，以加入等量乙醇和0.1% 吐溫-80 的無菌水作為空白對照。將準備好的種子轉移至含無菌水的培養皿中培養，選取生長一致的反枝莧或狗牙根放在濾紙上（每皿10 粒），在培養皿中分別加入5 mL 配制好的樣品和空白對照，每個處理重復3 次。培養條件同活性跟蹤組分，4 d 后測量莖或根的長度。抑制率=［空白對照平均根或莖葉長-處理平均根或莖長］∕空白對照平均根或莖長×100%。

2 結果與分析

2.1 化合物的結構鑒定

化合物1：白色粉末（CH3OH）；C22H25NO8，EIMSm∕z：454.8（［M+Na］+）；1H NMR（CD3OD，500 MHz）δ：8.26（2H，dd，J=7.4，1.5 Hz，H-19，23），7.68（1H，tt，J= 8.0，1.5 Hz，H-22），7.54（2H，dd，J = 8.0，7.4 Hz，H-20，21），6.24（1H，d，J = 9.2 Hz，OH-9），5.75（1H，d，J = 5.6 Hz，OH-10），5.40（1H，m，H-12），4.89（1H，d，J = 5.4 Hz，OH-11），4.46（1H，m，H-10），4.41（1H，d，J = 9.2 Hz，H-9），4.34（1H，t，J= 5.7 Hz，H-11），3.24（3H，s，OCH3-8），2.02（2H，m，H-14），1.64（3H，s，CH3-16），0.88（3H，t，J = 7.5 Hz，CH3-15）；13C NMR（CD3OD，125 MHz）δ：196.6（s，C-4），196.4（s，C-17），186.9（s，C-6），166.5（s，C-2），133.8（d，C-13，21），133.8（s，C-21），133.4（s，C-18），130.3（d，C-19），130.3（d，C-23），129.1（d，C-12），128.4（d，C-20），128.4（d，C-22），111.6（d，C-3），92.5（s，C-5），91.2（s，C-8），74.9（d，C-10），72.0（d，C-9），68.2（d，C-11），51.7（q，OCH3-8），20.7（t，C-14），14.1（q，C-15），5.9（q，C-16）。以上核磁數據與文獻［8］報道的Pseurotin A 的核磁數據基本一致，確定該化合物為Pseurotin A（圖1）。

化合物2：白色粉末（CH3OH）；C15H20N2O4S2，EIMSm∕z：379.7（［M+Na］+）；1H NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.00（1H，m，H-9），5.90（1H，m，H-8），5.64（1H，d，J= 9.7 Hz，H-7），4.83（1H，d，J= 13.7 Hz，H-5a），4.72（1H，d，J = 13.7 Hz，H-6），4.06（1H，dd，J = 11.4，5.3 Hz H-15a），3.73（1H，dd，J = 11.4，6.1 Hz，H-15b），3.12（1H，d，J = 15.6 Hz，H-10a），2.98（3H，s，CH3-13），2.81（1H，dd，J =15.6，1.1 Hz，H-10b），2.21（3H，s，CH3-14），2.19（3H，s，CH3-12）；13C NMR（CD3OD，125 MHz）δ：166.3（s，C-4），165.2（s，C-1），133.1（s，C-9a），130.6（d，C-7），123.5（d，C-8），119.3（d，C-9），73.7（d，C-6），72.8（s，C-3），71.5（s，C-11），69.0（d，C-5a），63.0（t，C-15），38.4（t，C-10），28.3（q，CH3-13），14.7（q，CH3-12），12.8（q，CH3-14）。以上核磁數據與文獻［9］報道的Bisdethiobis（methylthio）gliotoxin 的核磁數據基本一致，確定該化合物為Bis?dethiobis（methylthio）gliotoxin（圖1）。

圖1 化合物的結構

2.2 活性測試結果

活性跟蹤組分除草生測結果（表1）表明，Fr.5和Fr.8 對狗牙根和反枝莧具有除草活性，Fr.5 由于其中的化合物含量低且分離度低，未得到化合物單體，而Fr.8 中得到化合物2 量較少，因此，僅對化合物1 進行了進一步的除草活性測試。化合物除草生測結果（表2）表明，化合物1 對反枝莧具有除草活性，100 μg∕mL 時對反枝莧根的生長抑制率為32.91%。

表1 活性跟蹤組分對狗牙根和反枝莧的除草效果

表2 化合物1 對狗牙根和反枝莧的生長抑制作用

3 討論

通過活性跟蹤、大量發酵及分離純化，從活性菌株NBERC_51984 中得到了化合物Pseurotin A 和Bisdethiobis（methylthio）gliotoxin，通 過MS、1D 和2D-NMR 確定結構，并對NMR 數據進行了歸屬。活性測試結果表明，Pseurotin A 對反枝莧幼苗具有一定的生長抑制作用。關于Pseurotin A 除草活性的文獻較少，僅有報道其對小扁豆（Lens culinaris）有一定的植物毒性［10］，本試驗首次發現Pseurotin A 對反枝莧具有生長抑制作用，為除草真菌菌株NBERC_51984 的除草活性物質基礎，可對其進行進一步研究，為真菌源除草劑的發現提供良好的研究基礎。