企業微生物實驗室能力驗證的質量控制

張艷霞，蕭慧珍，于曉君，黃少云，房樹超

（完美（廣東）日用品有限公司，廣東中山 528454）

“人、機、料、法、環”是全面質量管理理論中影響質量的五個主要因素的簡稱[1]。對于微生物檢測而言，分別指檢測人員、儀器設備、培養基和試劑、檢測方法和環境設施條件。

從這5個主要因素探討微生物實驗室能力驗證的質量控制，確保檢測結果的準確性和有效性的同時提高檢測人員對病原菌檢測鑒定的技術水平，有助于實驗室發現和糾正自身存在的問題，促進微生物檢測向著更精確、更規范的方向發展。

1 檢測人員

微生物檢測涉及一系列復雜的系統工作，檢測人員的檢測技能、對檢測關鍵點的掌握以及操作的熟練程度對檢測結果的準確性具有直接影響。因此，檢測人員首先應具備微生物知識背景并持證上崗，具有高度的責任心和嚴謹認真、實事求是的工作態度，其次要具備扎實的業務能力和嫻熟的操作技術，能夠正確理解相關標準并規范地實施檢測。

能力驗證時，應安排責任心強、嚴謹、實際操作經驗豐富、具有較強分析問題和解決問題能力的人作為主檢人員，新進人員在主檢人員的指導和監督下，使用剩余樣品進行平行實驗，實現實驗室人員比對的同時，有效鍛煉和考察新進人員的檢測能力，避免偶然誤差的發生。

2 儀器設備

微生物實驗室檢測用的關鍵設備包括生物安全柜、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋和培養箱等，應按照國家相關法律法規要求對儀器進行檢定、校準或期間核查。日常檢測應正確操作儀器，做好日常保養維護和使用記錄，關注儀器的穩定性，防止儀器在檢測或培養過程中發生故障，減小儀器帶來的誤差并方便溯源。

2.1 高壓蒸汽滅菌鍋

作為檢測用品滅菌的關鍵設備，高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表應按規定定期送專業檢定單位進行強檢，定期對滅菌溫度進行校準確認并使用生物指示劑進行期間核查。每次滅菌時使用化學或物理指示劑確認滅菌有效性。實驗室應配備針對污染物滅菌的專用高壓滅菌鍋，避免交叉污染。另外，操作人員需經專業培訓并持證上崗，嚴格按照高壓滅菌鍋說明書進行操作。

2.2 培養箱

培養箱溫度的均勻性和溫度偏差對微生物生長具有較大影響，應定期進行使用溫度的校準和期間核查。日常監控中，應定期對培養箱進行高溫或消毒劑熏蒸消毒，并采用沉降菌或浮游菌檢測的方式對消毒效果進行確認；溫度監控可采用溫濕度記錄儀或無線溫度探頭等方式記錄和保存溫度數據，防止培養過程中培養箱發生故障，溫度出現失控。

3 培養基和試劑

微生物檢測用培養基、試劑、質控菌株和樣品是微生物檢測中不可缺少的一部分，對微生物繁殖、活力保證與鑒定等方面具有十分重要的影響。

3.1 培養基和試劑

培養基是人工配置的滿足微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養物質，其質量的好壞直接影響微生物檢測數據的準確性。

培養基和試劑到貨后，應先檢查產品合格證明、包裝的完整性和質控報告，符合要求的按GB 4789.28-2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢測 培養基和試劑的質量要求》進行包括物理性狀等基本要求、微生物污染和微生物生長特性等技術性驗收。培養基應嚴格按供應商提供的儲存條件、有效期和使用方法進行配制、滅菌、保存和使用。已開封的培養基應進行開封后使用有效期的驗證。另外，由于培養基復融可能導致其性能下降，故應盡量避免使用復融的培養基。

微生物檢測用培養基以商業化脫水合成培養基和即用型培養基最為普遍，雖然其具有方便快捷的優勢，但不同生產企業的原料成分、生產工藝與質量方面差別，導致其在微生物檢測過程中的增菌效果或生化反應存在一定的差異，因此建議同時儲備兩個或以上合格生產商的培養基以備質控需要。

3.2 質控菌株

質控菌株是購買微生物菌種保藏專門機構或同行認可機構保存的、可溯源的標準或參考菌株。質控菌株在能力驗證中主要用于培養基質量驗收、陰陽性對照和實驗室內部質控等。質控菌株在購回后，按相關要求進行驗收和合理保藏，其傳代、復蘇、保藏和使用需做好相應的記錄，使用時應保證始終處于受控狀態。另外，應定期對菌株進行菌種活力核查，活力衰退的菌株應及時做無害化處理，保證質控菌株的有效性。

3.3 樣品的檢查與確認

接收到能力驗證樣品后，應按能力驗證指導書的要求，核對樣品數量，檢查樣品外包裝和性狀。若樣品出現不能滿足指導書要求等任何疑問，應及時聯系組織方，必要時申請重新發樣。經確認的能力驗證樣品，應按要求儲存并在規定時限內檢測。

4 檢測方法

4.1 檢測方法的選擇

實驗室應優先按能力驗證組織方指定/推薦的檢測方法進行檢測，若組織方推薦多個測試方法，要考慮不同測試方法對結果的影響，一般推薦優先采用第一法。若組織方無指定檢測方法，可采用實驗室經認可的方法或國際通用方法。

4.2 制定實驗方案

能力驗證過程受多種因素影響，檢測人員在操作過程中難免存在對檢測關鍵點管控不當和操作不到位等情況，因此在能力驗證開展前，檢測人員應根據檢測方法和能力驗證組織方提供的指導書要求，擬定檢測操作流程和識別檢測項目的關鍵控制點，針對檢測過程中可能出現的問題，列舉操作細節的注意事項和相應的質控措施，整理輸出實驗方案。檢測過程中依據實驗方案開展檢測，保障能力驗證有序規范開展和檢測結果的準確可靠。

4.3 依據組織方的指導書復蘇樣品

冷藏條件會對樣品中菌體造成應激損傷，若樣品的復蘇不徹底或不均勻，受損菌體生物學特性未得到恢復，將削弱或抑制菌體在培養基上的生長能力，嚴重時會直接影響實驗結果，因此要嚴格按照組織方的指導書要求在規定時限內對樣品進行預處理，防止樣品中原有微生物發生變化。復蘇后的樣品應立即進行檢測，避免樣品中微生物在放置過程中由于環境或其他因素的影響而大量死亡。

能力驗證檢測過程應設置平行樣和陰陽性對照，保證實驗結果的準確性。陰性對照能防止因人為操作不當或培養基和檢測用品滅菌不徹底等因素造成的檢測結果不準確，而陽性對照有助于更好地判斷實驗效果和目標菌的形態特征。

4.4 定量項目

定量方法是對一定數量的樣品進行直接或間接測量被分析物數量的分析方法。一般采用實驗室人員對比和同一檢測人員的平行樣檢測等方式以提高檢測結果的準確性。

微生物能力驗證常見定量項目有菌落總數、霉菌、酵母菌、大腸菌群（MPN計數法和平板計數法）、金黃色葡萄球菌（平板計數法）和乳酸菌計數等，其檢測應考慮樣品處理、稀釋過程、加樣體積、培養基傾注、培養觀察以及菌落計數和結果報告等因素的質量控制。

4.4.1 樣品處理

以安瓶粉末為基質的能力驗證樣品，對西林瓶內容物進行水化時，應盡可能將原液吸出后，多次潤洗瓶內壁，防止滴、漏、濺、灑。

以顆粒狀玉米等為基質的樣品，在稱量前需充分混勻，樣品稱量和稀釋后建議使用均質器拍打，使樣品中微生物均勻分布于稀釋液中。

4.4.2 樣液稀釋和加樣體積

能力驗證時，在不清楚樣品適宜稀釋度的情況下，建議最少做6個稀釋梯度。樣液和稀釋液的混勻建議使用漩渦混勻器，在3 000 r/min下混合液漩渦至底后約3 s，保證混合均勻。因微生物繁殖速度快，檢測時間一般控制在15 min內完成。

菌落總數項目可考慮在培養基中添加TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）或使用3M測試片（由美國3M公司研制的微生物快速測試試紙）法等進行平行測試，提高計數結果的準確性。

檢測用的稀釋液建議滅菌后使用校準合格的無菌瓶口分液器進行分裝，降低高壓蒸汽滅菌對分裝后稀釋液體積的影響。滅菌后的瓶口分液器使用前需進行分液準確性的核查。使用移液器或玻璃移液管移液時，應注意按方法正確操作，移液器在使用前應進行移液準確性核查，確保加樣體積的準確性。

4.4.3 培養基傾注和培養觀察

培養皿加入樣品液后應盡快傾注溫度在46～48 ℃的培養基并搖勻。培養基溫度過高可能導致菌體死亡使計數數值偏低。培養基傾注的厚度要適宜，過薄會導致培養基在培養過程中水分過度蒸發出現干燥失水現象，菌落的生長發育缺乏充足的水分和營養供給，將導致計數結果不準確。

為防止培養的過程中菌落蔓延或菌落延緩生長對菌落計數的影響，可適當提前觀察計數或延長培養時間。

4.4.4 菌落計數和結果報告

同一檢測項目不同檢測方法對平板中菌落的適宜計數范圍、結果的計算方法以及報告的修約原則等要求有所不同，應按照檢測方法要求計數并出具最終結果。平板計數時應采取雙人計數，計數結果差異在10%以內判斷為結果一致[2]。

4.5 定性項目

定性方法是用直接或間接的方法檢測被分析物是否存在的分析方法。微生物定性檢測項目較多，常見的食品定性項目有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌O157等；化妝品定性項目有耐熱大腸菌群、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌等。定性項目的檢測關鍵點主要是劃線分離、可疑/典型菌落的選取和生化鑒定。

4.5.1 劃線分離

對樣品進行前處理后，應按檢測方法要求的溫度和時間培養，如方法的培養時間是一個范圍，應選擇接近終止的時間點結束培養并進行下一步操作，避免提前結束培養造成漏檢。有必要時可考慮使用能力驗證樣品原液在選擇性平板上劃線分離，為后續增菌液的選擇性平板劃線分離結果提供參考。

增菌液培養結束后，同一瓶增菌液在同一種選擇性平板上應至少劃線3塊。同一種選擇性平板，應設置劃線操作過程接種環不滅菌和接種環劃線第二區域前進行滅菌或更換接種環兩種接種方式的對比，以確保目標菌得到有效分離，避免增菌液中雜菌含量過高，目標菌在選擇性平板中被雜菌覆蓋造成漏檢。

4.5.2 可疑/典型菌落的選取

不同定性項目對選擇性平板中可疑/典型菌落生化鑒定的菌落數要求不一樣，如GB 4789.36-2016對大腸埃希氏菌O157要求分別挑取5～10個可疑菌落，而GB 4789.4-2016對沙門氏菌則要求分別挑取2個以上典型/可疑菌落進行初步生化鑒定。應按檢測方法要求選取足夠數量的典型/可疑菌落進行后續的生化鑒定。若方法要求的選擇菌落數是一個范圍，應以最大選擇數為準，防止漏檢的同時提高檢測效率。

挑取的可疑/典型菌落建議先接種TSA平板，從培養后的TSA平板上挑取菌落進行后續的生化鑒定，確保后續生化鑒定項目結果來自同一個單菌落，同時排除選擇性平板上菌落的顏色反應對生化鑒定的干擾。

4.5.3 生化鑒定

為保證檢測的準確性和高效性，可疑/典型菌落應按方法規定的鑒定流程先進行初步生化鑒定，篩選出目標菌落再進行后續鑒定。若檢測項目較多且樣品量較大，一旦某個樣品已明確陽性結果，應盡快結束相關實驗，將主要精力放在疑難樣品上。

4.5.3.1 陰陽性對照

生化實驗需要使用質控菌株作陰陽性對照時，應按檢測方法要求使用相應或等效菌株，否則將影響生化實驗結果的判斷，最終影響到能力驗證結果。

GB 4789.36-2016中 的MUG（4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷）實驗要求使用大腸埃希氏菌ATCC 25922或等效標準菌株作陽性對照。在檢測時，本實驗室檢測人員發現實驗室保藏的大腸埃希氏菌ATCC和大腸埃希氏菌8099能分解MUG產熒光，MUG實驗結果陽性，而大腸埃希氏菌ATCC 8739則不產熒光，MUG實驗結果陰性。實驗結果表明，大腸埃希氏菌8099可作MUG實驗陽性對照的等效標準菌株，而大腸埃希氏菌ATCC 8739則為非等效菌株，若使用ATCC 8739作MUG實驗陽性對照菌株，將導致實驗結果誤判。因此，在日常檢測和能力驗證時，應注意正確選擇生化實驗陰陽性對照菌株，排除非等效菌株對實驗結果的干擾。

4.5.3.2 血清學實驗

在生化鑒定項目中，血清學實驗和動力實驗難度較大。林秀敏等[3]的文章中指出，菌落分離純化培養基對菌體抗原和鞭毛抗原誘導有一定影響，Swarm軟瓊脂對鞭毛抗原具有很好的誘導效果，能使發育不良或暫時缺失的鞭毛抗原得以恢復，且容易挑取培養物，可操作性強，能很好地解決半固體平板培養物難以挑取的問題。

在日常檢測中，使用半固體瓊脂上的大腸埃希氏菌O157：H7 NCTC 12900和CICC 21530標準菌株培養物做H7因子血清學實驗時，常出現培養物挑取可操作性差，凝集效果不明顯或需多次連續接種的問題。使用Swarm軟瓊脂進行平行實驗時，Swarm軟瓊脂上培養物容易挑取，第一次接種的培養物H7因子血清均凝集且效果明顯。因此，血清學實驗或動力學實驗可使用Swarm軟瓊脂代替半固體瓊脂，提高實驗效率。

5 環境設施條件

實驗環境是保障微生物結果可靠的前提，能力驗證開展前，潔凈室應進行徹底消毒，有效地保證生物安全柜的無菌環境，排除外界微生物污染樣品的風險和不受其他有害因素的影響。保證實驗室溫度、濕度等環境條件符合檢測要求。

能力驗證過程中，須嚴格落實無菌操作，防止能力驗證樣品之間、環境與樣品之間以及樣品和陽性對照之間的交叉污染。同時應設置空白對照，陽性對照實驗則安排在所有能力驗證樣品操作完畢后。若條件允許，不同的樣品在不同的生物安全柜內操作，若在同一生物安全柜內操作，不同樣品逐個操作并做好樣品操作間隙的消毒殺菌工作。

6 結語

能力驗證是利用實驗室間比對考察實驗室檢測能力的重要手段，不僅能有效監控實驗室的檢測過程，證明其檢測數據的可靠性，更有助于實驗室發現和糾正自身存在的問題，識別實驗室間的差異，指導實驗室持續提高技術能力和管理水平。企業微生物實驗室應積極參與國內外能力驗證，認真研讀能力驗證組織方的技術報告，獲取同一檢測項目不同檢測方法間差異的信息，同時關注本實驗室能力驗證結果在技術報告中的Z值[4]，有必要時對該項目進行風險評估，識別出隨機誤差、系統誤差或人為錯誤等導致的問題并采取相應的預防措施，使能力驗證結果得到正確的總結和應用，進一步提高實驗室的分析和檢測能力，提升實驗室在行業內的競爭力和影響力。