亞硫酸鉍瓊脂平板培養基驗收研究

金倩儀

（中山市食品藥品檢驗所，廣東中山 528437）

在微生物的試驗過程中，培養基的質量直接影響檢驗結果，這其中包含了培養基自身質量的優劣、配制和使用方法是否正確、保存是否符合條件等過程[1-2]。沙門氏菌檢驗是食源性微生物檢測的常規項目，該項檢測實驗中使用的培養基為亞硫酸鉍（BS）瓊脂培養基，檢測中一般購買商品化的BS瓊脂平板直接進行菌種檢測，也可購買BS瓊脂干粉制作平板用于檢測（現用現配），培養基中的亞硫酸鉍指示劑可以抑制革蘭氏陽性菌和大腸菌群生長，但不影響沙門氏菌的生長。

在沙門氏菌檢驗中，BS瓊脂平板培養基的質量關系到沙門氏菌檢測結果的準確性。因此，選擇傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌和糞腸球菌4種菌株對BS瓊脂培養基進行選擇性和生長率的檢驗，探究影響BS瓊脂平板培養基驗收結果的相關因素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

傷寒沙門氏菌[CMCC(B)50071]，廣東省微生物菌種保藏中心提供；鼠傷寒沙門氏菌[ATCC 14028]、大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、糞腸球菌（ATCC 29212），美國 MicroBioLogics ATCC。

Quintix2102-1CN電子天平，賽多利斯貿易有限公司；KB400生化培養箱，賓德亞太有限公司；SG603A-HE生物安全柜，美國BAKER公司。

1.2 檢驗環境

遵循無菌操作原則在二級生物安全實驗室進行檢測。

1.3 試驗方法

1.3.1 平板制作

稱取適量的亞硫酸鉍瓊脂干粉加水進行煮沸滅菌，待冷卻至40 ℃后傾注平板（直徑90 mm的平皿，通常要加入15～25 mL瓊脂培養基），放到水平平面待瓊脂凝固。需要在使用前一天配置，可常溫放置于生物安全柜到第2天直接使用。

1.3.2 接種方法

傷寒沙門氏菌（菌株T1）和鼠傷寒沙門氏菌（菌株T2）作為目標菌，采用目標菌半定量方法。如圖1a所示，用1 μL的接種環分A、B、C、D四個區進行劃線，A、B、C三個區按0.5 cm的間隔劃4條平行線，D區內劃一條連續的曲線[3]。大腸埃希氏菌（N1）和糞腸球菌（N2）作為非目標菌，采用非目標菌半定量方法。如圖1b所示，用1 μL的接種環取1環工作懸液在待測培養基表面劃6條平行線。接種后的平板倒置培養于（36±1）℃培養箱中40～48 h。

圖2 目標菌和非目標菌半定量劃線法接種模式圖

1.3.3 試驗設置

選用同一生產廠家兩個批號的BS瓊脂干粉配制新鮮培養基并制作BS瓊脂平板（命名為BS1、BS2）和另一生產廠家兩個批號的商用BS瓊脂平板（BS3、BS4），分別使用4種菌株（T1、T2、N1、N2）的新、舊菌株進行劃線和菌種培養。

1.3.4 接種結果評價

培養后，評價菌落的形狀、大小和生長密度，并計算生長指數G。每條有比較稠密菌落生長的劃線則G為1；如果僅有一半的線有稠密菌落生長則G為0.5；如果沒有菌落生長、生長量少于劃線的一半或菌落生長微弱則G為0[4]。記錄每個平板的得分總和便是G值，目標菌的G值一般是≥6，非目標菌的G值一般≤1。

2 結果與分析

不同類型、不同批號的亞硫酸鉍瓊脂平板的驗收結果如表1所示。BS1使用鼠傷寒沙門氏菌（T2）舊菌株劃線的平板生長指數不符合標準要求，但是用新菌株劃線的平板是符合要求的；BS2的所有菌株劃線的平板都在標準要求范圍內，因此該批號的BS瓊脂干粉培養基通過了培養基驗證；BS4瓊脂平板使用傷寒沙門氏菌（T1）劃線的平板均沒有生長，且使用糞腸球菌（N2）舊菌株劃線的平板生長指數也超出標準要求；BS3瓊脂平板使用傷寒沙門氏菌（T1）舊菌株劃線其生長指數偏低，且糞腸球菌（N2）舊菌株的劃線平板也超出了正常生長。為此，對所有菌株進行一次驗證實驗，發現糞腸球菌（N2）的舊菌株受到了污染，有雜菌；同時，舊菌株活性比新菌株差，因此舊菌株的結果不可作為培養基驗收結果。由于BS4瓊脂平板的傷寒沙門氏菌（T1）的G值不符合標準要求，判定該批次的平板不合格。

表1 亞硫酸鉍瓊脂驗收實驗結果

GB 4789.28-2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》表明，每次進行驗收都應進行菌株的純度和形態驗證，在保存和使用時應注意避免交叉污染，本次實驗可說明使用后的菌株不宜反復使用，最好是當天廢棄銷毀。每次打開后易交叉污染，一旦發現菌株有污染現象應立即處理掉并換新的工作菌株，且舊的菌株即便是不被污染，也可能會因為傳代次數過多而失去活力。運輸條件和儲存條件對培養基質量影響也是不可忽視的，對溫度有要求的培養基應在收到后立即轉存。生產商在送出時也應該和物流溝通好，確保運輸過程中不會影響到培養基的質量。而且平板的配置、儲存也有一定的要求，一般已配置的平板保存不超過4周，且要求保存在2～8 ℃條件下。已配置的平板在使用前也要觀察是否有異常，而BS平板配置與一般培養基不同，需要在使用前一天配置，可常溫放置于生物安全柜至第2天使用。如果培養基購置后還未進行培養基驗證又需要立即使用時，可以進行實驗的時候同時進行培養基的驗收實驗，在用實驗生長出的菌進行平板劃線時同時使用陰陽性菌株劃線，通過結果反饋來驗證培養基是否符合驗收標準，在得到比較準確的驗收結果的同時，觀察培養基在日常檢驗中的使用狀況。

3 結論

同一生產商不同批號、不同狀態生產的培養基質量有優劣之分并不穩定。因此，培養基驗收實驗[5-6]是不可或缺的一個步驟，這直接影響了實驗結果。不同的培養基應參照GB 4789.28-2013《食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》進行驗收試驗。實驗室可以多采購不同品牌的培養基使用，通過多次驗收實驗以及使用心得來選購符合本實驗室實際狀況的培養基。