3-硝基丙酸誘導(dǎo)小鼠睪丸氧化應(yīng)激模型的建立

王慧瑞， 賀海旺， 于佳彤， 郭 庸， 趙晨序， 柳海星

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000)

3-硝基丙酸(3-Nitropropionic acid，3-NPA)可以抑制細(xì)胞線粒體功能從而導(dǎo)致細(xì)胞ATP缺乏[1]，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[2-3]。其主要存在于甘蔗中，特別是一些發(fā)紅的甘蔗，在一些高等植物中也存在3-硝基丙酸[4]。在正常的自然條件下，曲霉屬和青霉屬中的少數(shù)菌種也會(huì)生成3-NPA這種具有毒性的代謝產(chǎn)物。氧化應(yīng)激是指氧自由基在機(jī)體的氧化還原平衡被破壞的情況下大量積累。過(guò)量的氧自由基可引起細(xì)胞損傷和凋亡[5-8]。氧化應(yīng)激在生活中也是無(wú)處不在。在正常的生理情況下，機(jī)體為了減少氧化應(yīng)激的損害，細(xì)胞會(huì)通過(guò)清除多余的自由基使其生成與降解維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)。但是當(dāng)其處于病理狀態(tài)的情況下，就會(huì)引起如心臟病、癌癥、老年癡呆癥、帕金森病和腫瘤[9]等多種人類相關(guān)疾病，而造成這些疾病的原因則是鏈?zhǔn)街具^(guò)氧化引起的細(xì)胞或者組織的損傷。近年來(lái), 國(guó)內(nèi)外研究表明, 氧化應(yīng)激能夠引起睪丸相關(guān)的疾病，如男性不育癥(與精液有關(guān))[10-13]。氧化應(yīng)激在人類輔助生殖領(lǐng)域中可以引起體外胚胎老化、發(fā)育受阻、凋亡等危害作用[14]。為探究氧化應(yīng)激對(duì)生殖功能的影響和對(duì)生殖提供穩(wěn)定的模型，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)3-NPA誘導(dǎo)建立氧化應(yīng)激模型，旨在研究氧化應(yīng)激對(duì)睪丸損傷及其發(fā)育機(jī)制，同時(shí)為篩選可以抵御睪丸氧化應(yīng)激的抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)所用小鼠均由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，6～8周齡，體重20～25 g的性成熟具有生育能力的昆明小鼠，雌性與雄性各20只。飼養(yǎng)條件為室溫(23±3) ℃，相對(duì)濕度保持在40%～70%，晝夜明暗交替時(shí)間一般為12 h，自由采食，自由飲水。

1.1.2 試劑

三硝基丙酸(上海遠(yuǎn)慕生物有限公司)；氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫、二水氯化鈣、七水硫酸鎂、乳酸鈉、丙酮酸鈉、葡萄糖、牛血清白蛋白、4-羥乙基哌嗪乙磺酸及磷酸二氫鉀(SIGMA公司)；青霉素鈉、硫酸鏈霉素，均為山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；總超氧化物歧化酶測(cè)試盒(T-SOD)、丙二醛測(cè)定試劑盒(MDA)、過(guò)氧化氫酶測(cè)定試劑盒(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶測(cè)定試劑盒(GSH-PX)、雙縮脲蛋白定量試劑盒 (BCA)(南京建成生物工程研究所)。

1.1.3 主要儀器

生物超凈工作臺(tái)，精密電子天平，雙開(kāi)門冰箱，電熱智能恒溫水浴鍋，立式壓力蒸汽滅菌器，漩渦震蕩儀，臺(tái)式pH測(cè)量?jī)x，臺(tái)式微量高速離心機(jī)，漩渦混合器，Tecan infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀，精子質(zhì)量分析儀，高速冷凍離心機(jī)，實(shí)驗(yàn)室磁力攪拌器，高壓消毒鍋，熒光顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 模型建立

20只雄性成年昆明小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周，之后稱重并隨機(jī)分為模型組(低濃度、中濃度、高濃度)、對(duì)照組。模型組小鼠腹腔注射 3-NPA，劑量分別為6.25、12.5和25 mg/kg，每天注射2次(早晚各1次，中間間隔12 h)，對(duì)照組小鼠注射等劑量生理鹽水，注射7 d，誘導(dǎo)建立小鼠睪丸氧化應(yīng)激模型。

1.2.2 睪丸組織形態(tài)學(xué)觀察

組織樣本的處理，沖洗、脫水以及透明，浸蠟、包埋，切片、展片，脫蠟，HE染色和封片。

1.2.3 繁殖性能測(cè)定

最后1次注射后，將所有雄性小鼠與經(jīng)過(guò)發(fā)情處理的正常母鼠進(jìn)行配對(duì)合籠，之后觀察記錄小鼠的見(jiàn)栓數(shù)并計(jì)算見(jiàn)栓率。待這些母鼠生產(chǎn)后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)子數(shù)。增重、器官指數(shù)、睪丸指數(shù)和見(jiàn)栓率計(jì)算如下。

增重=注射后體重-注射前體重；

器官指數(shù)=器官重量/體重；

睪丸指數(shù)=(睪丸重量+附睪重量)/體重；

從表3中可以看出，惠州港防臺(tái)期間走錨船舶中既有一般散雜船，也有危險(xiǎn)品運(yùn)輸船舶。由于在港防臺(tái)船舶數(shù)量多，種類全，錨泊安全間距不足，船舶一旦發(fā)生走錨、碰撞險(xiǎn)情，容易造成人員傷亡和海域污染事故，防臺(tái)安全形勢(shì)嚴(yán)峻。

見(jiàn)栓率=見(jiàn)栓小鼠數(shù)/配對(duì)小鼠總數(shù)×100%。

1.2.4 精液質(zhì)量的測(cè)定

主要是對(duì)小白鼠附睪尾中精子密度、活率、直線速度、平均側(cè)擺幅值等指標(biāo)的測(cè)定。末次注射后12 h，隨機(jī)選取5只小鼠頸部脫臼處死，然后取出附睪尾部，用手術(shù)剪剪4～6個(gè)小口并將其放入事先準(zhǔn)備好的HTF培養(yǎng)液中，在恒溫控制儀上放置5 min左右，讓精子自由出入。之后用微量移液器反復(fù)吹吸，讓培養(yǎng)液與精子完全混合，取少量混合液置于預(yù)熱的載玻片上，使用精子質(zhì)量分析儀分析精子各項(xiàng)指標(biāo)，重復(fù)測(cè)定 3 次。

精子活率/% =活動(dòng)精子數(shù)/精子總數(shù)×100%

1.2.5 睪丸組織抗氧化相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取組織重量，按睪丸重量/g∶生理鹽水/mL=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下，制備成10%的組織勻漿。用T-SOD，BCA,CAT,MDA,GSH-PX測(cè)定相關(guān)指數(shù)，所有試劑盒均按說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)的各個(gè)數(shù)據(jù)都用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示(x ±s)，以單因素方差分析進(jìn)行組間差異的比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 3-NPA小鼠對(duì)睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響

圖1 3-NPA對(duì)小鼠睪丸結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effect of 3-NPA on the structure of testis in mice

2.2 3-NPA小鼠對(duì)繁殖性能的影響

由表1可以看出，與對(duì)照組相比，3-NPA處理組的見(jiàn)栓率與平均產(chǎn)子數(shù)均顯著降低(P<0.05)。低濃度組、中濃度組與高濃度組3組小鼠增重均有所減少，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；睪丸指數(shù)也是隨著3-NPA的濃度上升而下降，低濃度組較對(duì)照組有所降低，但差異不顯著(P<0.05)，而中濃度組與高濃度組有明顯的下降(P>0.05)。說(shuō)明經(jīng)3-NPA處理的中濃度組與高濃度組對(duì)睪丸的氧化應(yīng)激有著比較明顯的影響。精囊腺指數(shù)也隨著3-NPA濃度的上升而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，低濃度組與對(duì)照組相比，有下降但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而中濃度組和高濃度組則較對(duì)照組有顯著降低(P<0.05)。

表1 3-NPA對(duì)小鼠繁殖性能的影響Table 1 Effect of 3-NPA on reproductive performance of mice

2.3 3-NPA對(duì)小鼠精液質(zhì)量的影響

由表2可以看出，與對(duì)照組相比，3-NPA注射組的精子密度與精子活率均呈下降趨勢(shì)。其中，低濃度組的精子密度與對(duì)照組相比，無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但中濃度組與高濃度組較對(duì)照組有顯著性下降(P<0.05)；3-NPA注射組的精子活率則較對(duì)照組均是顯著性下降(P<0.05)。而不同濃度3-NPA注射組小鼠精子各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)指標(biāo)較對(duì)照組都無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 3-NPA對(duì)小鼠精子質(zhì)量的影響Table 2 Effect of 3-NPA on sperm quality in mice

2.4 3-NPA小鼠對(duì)睪丸組織氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

由表3可以看出，MDA和SOD低濃度組處理組與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)，而其中濃度組與高濃度組以及GSH-PX與CAT的3-NPA各濃度處理組均是顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。這就說(shuō)明了3-NPA能夠有效引起睪丸氧化應(yīng)激，睪丸通過(guò)提升組織中的抗氧化酶活性來(lái)達(dá)到與氧化應(yīng)激的對(duì)抗，進(jìn)而使自身的氧化損傷降到最低。

表3 3-NPA對(duì)MDA濃度和抗氧化酶SOD、GSH-PX、CAT活性的影響Table 3 Effects of 3-NPA on MDA concentration and activities of SOD, GSH-PX and CAT

3 討論與結(jié)論

國(guó)內(nèi)外關(guān)于哺乳動(dòng)物睪丸氧化應(yīng)激模型的報(bào)道很少，但已確定四氧嘧啶[15]、重金屬鉛、香煙煙霧[16]、亞硫酸鈉[17]、山梨醇和蜜三塘[18]都會(huì)造成睪丸損傷，從而使睪丸的發(fā)育受到影響，這些報(bào)道中對(duì)睪丸的損傷不單是因氧化應(yīng)激而產(chǎn)生，這其中的大多數(shù)都是因?yàn)閷?duì)全身綜合性的損傷而造成。這使對(duì)睪丸氧化應(yīng)激所造成損傷過(guò)程的研究變得十分困難，而且對(duì)選取一些可以抗睪丸氧化損傷的藥物也造成極大的不便利。而3-NPA主要存在于甘蔗中，特別是一些發(fā)紅的甘蔗，在一些高等植物中也存在3-硝基丙酸，其獲得途徑十分便捷。

通過(guò)對(duì)睪丸組織形態(tài)學(xué)的觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比較，3-NPA注射組的睪丸各生精細(xì)胞之間的排列顯得更加紊亂，生精小管內(nèi)的各級(jí)生精細(xì)胞的連接處也顯得十分疏松，細(xì)胞之間的間隙也在增大，曲細(xì)精管上皮的管壁也變得更薄，而且還會(huì)有一些空腔產(chǎn)生。

該試驗(yàn)的結(jié)果顯示，注射3-NPA對(duì)小鼠的增重?zé)o顯著影響。而精囊腺指數(shù)顯著性降低，進(jìn)而使其睪丸指數(shù)顯著性降低。該模型使精子密度與活性降低，以此使精囊腺指數(shù)降低從而影響睪丸指數(shù)，最后影響小鼠生育能力。這一系列的影響最終導(dǎo)致小鼠的見(jiàn)栓率與產(chǎn)子數(shù)顯著性降低。這些數(shù)據(jù)可以證明，3-NPA對(duì)小鼠的生育能力有顯著性的抑制作用。

3-NPA的注射通過(guò)使小鼠的精子密度與活性顯著性降低，但3-NPA對(duì)精子的運(yùn)動(dòng)則沒(méi)有顯著性的影響。還造成睪丸內(nèi)部各生精組織之間的排列紊亂，從而造成精子量以及其質(zhì)量的減少。因此，可以根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推斷，注射3-NPA可以使小鼠睪丸氧化應(yīng)激模型成功建立。這個(gè)模型與人類的卵巢損傷病變[19](正常氧化應(yīng)激情況下引起)為一類模型。

通過(guò)試驗(yàn)中對(duì)酶活性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，3-NPA注射組中MDA的含量以及各種抗氧化酶SOD、CAT和GSH-PX等的含量都會(huì)顯著性增加，這就說(shuō)明3-NPA能夠有效的引起睪丸氧化應(yīng)激，睪丸通過(guò)提升組織中抗氧化酶的活性以此來(lái)達(dá)到與氧化應(yīng)激的對(duì)抗，進(jìn)而是自身的氧化損傷降到最低。

所以結(jié)合上面的數(shù)據(jù)可以得出，通過(guò)腹腔注射3-NPA，可以建立一種可靠的小鼠睪丸氧化應(yīng)激模型。制作該模型的3-NPA最適濃度為中濃度組，也就是12.5 mg/kg。該模型操作簡(jiǎn)單，且節(jié)省試驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。對(duì)于研究氧化應(yīng)激對(duì)睪丸損傷及其發(fā)育機(jī)制有非常重要的意義，同時(shí)它也為篩選可以抵御睪丸氧化應(yīng)激的抗氧化劑提供理論依據(jù)。