文冠果實生后代氮素利用效率差異分析

馬縱橫， 崔銘洋， 胡 楠， 羅廣軍*

(1.延邊大學農學院，吉林 延吉 133000；2.安陽工學院生物與食品工程學院，河南 安陽 455000)

20世紀60～70年代，我國農業氮肥施用量驟然上升，截止2013年，中國已是世界上最大的氮肥生產和消費國家，分別占世界總量的60%和52%[1]。氮肥的過度施用破壞了自然界中氮素的平衡，影響生物圈氮素循環和生態系統的穩定性[2-3]。植物營養分析和農業生長實踐表明，過多施用氮肥不能增加產量，反而造成土壤板結和內源氮素的過量流失[4-5]。無效施肥即過量施肥與農業產量和環境之間的關系已經成為當今中國農業生產存在的主要矛盾[6-7]。

氮是蛋白質的主要成分，蛋白質含氮量在15%～18%。蛋白質又是組成生物體的基礎物質，生命現象中起到主要承載和執行作用。葉綠素是植物光合作用中重要的捕光色素，對植株的關鍵性生命活動具有重要的意義。由于N素在植物體內極易移動，在植株缺乏氮素供應時，N素會從老的組織中轉運到幼嫩組織中，從而加速葉的衰老。因此，氮脅迫會影響葉片發育，減少葉面積，進而使植株光合作用降低；同時，葉綠素的合成途徑受阻，葉綠素含量減少，葉片黃化；植株生長減緩，產量降低[8-11]。

近幾年，人們逐漸意識到過度施用氮肥已成為制約環境保護順利開展的關鍵因素之一。如何在減少氮肥施用的同時，又能夠充分發揮氮素在林木生長發育過程中的作用，達到減施不減產質的效果，是目前關注的焦點問題。隨著研究的不斷深入，利用植株本身對不同養分脅迫耐受性的差異來進行篩選優異材料，提高材料的氮素利用效率，是該研究關心的科學問題之一。

1 材料與方法

1.1 材料

該試驗以5年生文冠果112個實生后代和母樹的扦插苗作為試驗材料，2012年春季播種，2017年選擇半木質化新梢進行綠枝扦插，扦插方法參照金香花等[12]人的方法， 扦插生根50 d后移栽水培處理，30 d后進行脅迫處理。篩選的優系命名為氮素高效利用(Nitrogen Efficient, NE)，母樹(MS)作為對照材料。

1.2 方法

低氮脅迫采用0.2 mmol/L氮營養液，對照組為完全培養液。在脅迫處理15、30、45、60 d后，利用米尺和游標卡尺測定植株的株高、莖粗、新梢長度，分光光度計測定葉綠素含量、SOD、POD酶活以及MDA含量[13]，使用便攜式光合測定儀測定凈光合速率、蒸騰速率生理指標[14]。

1.3 數據處理

采用SPSS對數據進行方差分析，采用Student’st測驗分析成對樣本，采用鄧肯新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 氮高效利用文冠果的篩選

伴隨著低氮脅迫處理時間的延長，植物會表現出葉片變小且老葉部分或全部變黃的外觀特征，進而造成葉片早期脫落。以脅迫處理60 d數據作為篩選依據，在112個株系中選取各指標前30%優異株系，以母樹相關指標作為參考，綜合株高、莖粗、新梢長度、凈光合速率和蒸騰速率指標得到8個氮高效株系(表1)。

表1 文冠果氮高效利用株系形態和生理指標篩選(60 d)Table 1 Changes in phenotype of NE lines under low-nitrogen treatment

續表1 文冠果氮高效利用株系形態和生理指標篩選(60 d)Continue to table 1 Changes in phenotype of NE lines under low-nitrogen treatment

篩選出來的氮素高效利用的8個株系，在株高、莖粗和新梢長度顯著高于母樹(表1)，低氮脅迫處理情況下，植物可以通過體內合成和轉運氮抵御環境變化，從而保證植株正常生長發育。另外，凈光合速率和蒸騰速率能夠反應植株光合作用和新陳代謝的變化規律，植物受到逆境脅迫情況下，凈光合速率和蒸騰速率會顯著下降，下降的幅度可以作為植物抵御逆境脅迫的強弱標準。母樹低氮處理60 d后，凈光合速率和蒸騰速率下降50%，而篩選出來的氮高效利用株系下降20%左右，下降幅度顯著低于母樹低氮處理。綜合以上數據表明，在112個文冠果實生后代中篩選出來的8個株系符合低氮處理下能夠高效利用氮素，其中，編號DN-34，DN-83和DN-100株系高效利用氮素效果更好，作為接下來試驗株系。

2.2 低氮處理對文冠果植株形態指標的影響

在8個氮高效利用文冠果植株中選擇編號DN-34，DN-83和DN-100 3個株系進行低氮(0.2 mmol/L N)處理，采用母樹作為對照。調查低氮處理過程中株系植株高度、新梢長度和莖粗動態變化。隨著脅迫時間的延長，氮高效利用株系的植株高度(圖1)、莖粗(圖2)和新梢長度(圖3)顯著高于對照組(母樹)。處理初期差異不顯著，顯著差異主要出現在脅迫處理30 d后。綜合表型指標數據，充分說明篩選出來的植株相比母樹來說，能夠抵抗低氮處理。

圖1 低氮(0.2 mmol/L N)處理對文冠果植株高度的影響Fig.1 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on plant height of Xanthoceras sorbifolia

圖2 低氮(0.2 mmol/L N)處理對文冠果植株莖粗的影響Fig.2 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on plant steam diameter of Xanthoceras sorbifolia

圖3 低氮(0.2 mmol/L N)處理對文冠果植株新梢長度的影響Fig.3 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on length of new stem of Xanthoceras sorbifolia

2.3 低氮處理對文冠果植株光合和蒸騰速率的影響

低氮處理條件下，氮高效利用株系凈光合速率逐漸上升后基本平穩不變，受脅迫影響較少，而母樹隨脅迫處理時間延長，光合速率呈逐漸降低的趨勢(圖4)。

圖4 低氮(0.2 mmol/L N)處理對文冠果植株凈光合速率的影響Fig.4 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on net photosynthetic rate of Xanthoceras sorbifolia

隨著處理時間的延長，氮高效利用株系蒸騰速率整體呈現逐漸下降的趨勢，而母樹蒸騰速率先上升后基本保持不變(圖5)。氮高效利用株系光合速率較高，蒸騰速率較低，凈積累量大，更利于植株本身的生長。氮高效利用株系蒸騰速率相比母樹來說比較低，降低蒸騰是植物對于外界環境的一種保護機制，造成脅迫處理蒸騰速率降低和光合速率升高的原因還有待于進一步研究。

圖5 低氮(0.2 mmol/L N)處理對文冠果植株蒸騰速率的影響Fig.5 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on transpiration rate of Xanthoceras sorbifolia

2.4 低氮處理對文冠果植株防御系統的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是消除活性氧損傷過程中的第1道防線，是保護酶系統中的關鍵酶，SOD是衡量植物抵御脅迫能力的重要指標。隨著處理時間的延長，氮素高效利用株系SOD含量升高，母樹基本保持不變(圖6)，這說明母樹沒有調配更高的SOD酶活的能力，不能清除脅迫產生的氧化物質，而文冠果氮高效利用株系受到了脅迫后，SOD增高說明該株系能夠清除逆境脅迫下氧自由基的產生，維持植株正常生長發育。過氧化物酶(POD)和SOD變化趨勢基本一致，POD在處理60 d時，文冠果氮高效利用株系有微弱下調，這可能是隨著處理時間的延長，防御機制將要開始全面瓦解(圖7)。

圖6 低氮(0.2 mmol/L N)處理對文冠果植株SOD含量的影響Fig.6 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on SOD content in Xanthoceras sorbifolia

圖7 低氮(0.2 mmol/L N)處理對文冠果植株POD含量的影響Fig.7 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on POD content in Xanthoceras sorbifolia

丙二醛(MDA)是反映植物體膜脂過氧化程度的指標，丙二醛含量升高是活性氧持續累積的結果，導致細胞膜質嚴重過氧化。低氮脅迫處理后，文冠果氮素高效利用株系MDA含量略有上升基本不變，對照組(母樹)隨著持續低氮處理， MDA含量不斷升高(圖8)。說明母樹在脅迫處理下細胞膜開始被氧化且不斷增加，而氮高效利用株系氧化程度基本不變，保持正常生命活動。

圖8 低氮(0.2 mmol/L N)處理對文冠果植株MDA含量的影響Fig.8 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on MDA content in xanthoceras sorbifolia

在逆境條件下(旱、鹽堿、熱、冷、凍)，植物體內脯氨酸(Pro)的含量顯著增加。植物體內脯氨酸(Pro)含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗逆性強的物種往往積累較多的脯氨酸。低氮脅迫下，氮高效利用植株顯著增加，而對照組(母樹)基本不變或變化不大(圖9)，文冠果氮高效利用株系積累更多的脯氨酸來抵御低氮逆境脅迫，說明脯氨酸和低氮脅迫具有一定的聯系。這可能是高濃度的脯氨酸可以參與氮代謝過程，從而為植株提供更多可以利用的氮。

圖9 低氮(0.2 mmol/L N)處理對文冠果植株Pro含量的影響Fig.9 Effect of low nitrogen(0.2 mmol/L N)treatment on Pro content in xanthoceras sorbifolia

3 討論

低氮處理后，對照組(母樹)表現出黃化的現象，而氮高效利用的文冠果植株黃化程度明顯降低。葉片黃化是由于葉綠素合成受阻，而植株葉綠素的含量與全氮養分含量密切相關，通常作為氮素養分脅迫的重要指標。光合作用是植株生長過程中能量和物質的基礎，還是各種生理和水肥條件的綜合反映[15]，而光合指標中凈光合速率對植株的影響程度最大[16]。有研究發現，隨葉片氮含量的增加，光合速率明顯增加[17]。該試驗中，文冠果氮高效利用植株中葉片凈光合速率相比對照組更高。氮高效小麥品種的光合速率和光合碳同化能力更高，且發現較高的暗反應速率是改善氮高效小麥品種物質生產能力的重要內在原因[18]。而在該研究中，氮高效利用植株在脅迫處理時，2個光合指標均在增長，而對照組(母樹)在下降，表明氮高效利用植株在低氮脅迫下能保持較高的氮素積累，提高自身光合生產能力，保證氮高效品種在低氮條件下具有養分吸收所受影響不大的能力，這也為提高根系對養分的吸收利用從而達到減少肥料施用的效果提供重要的材料和理論基礎。

植物體內保護酶是植物抵御外界逆境信號重要的保護機制，不同植株保護酶活性的差異常常是決定其抗逆性的關鍵。低氮處理對于植株來說是一種非生物脅迫，體內的保護酶在一定程度上參與其中。該試驗結果表明，低氮處理情況下，SOD和POD酶活顯著上升，與此同時丙二醛含量基本保持不變，這說明氮高效利用文冠果植株能夠提高自身的抗氧化機制，保護自身的細胞膜不被破壞，從此維持正常的生命活動。植物體內脯氨酸的合成有2條途徑：1) 以谷氨酸(Glu)為底物合成脯氨酸；2) 以鳥氨酸為底物合成脯氨酸。通常在植物受到脅迫或氮素缺乏的情況下，脯氨酸的主要來源就是谷氨酸合成途徑，在氮素供應充足的情況下，植物中脯氨酸的主要合成途徑是以鳥氨酸為底物合成的。在生物體內，脯氨酸不僅僅是理想的滲透調節物質，而且還可作為膜和酶的保護物質及自由基清除劑，從而對植物在滲透脅迫下的生長起到保護作用，對于鉀離子生物體內另外一種重要的滲透調節物質在液泡中的積累情況，脯氨酸又可起到對細胞質滲透平衡的調節作用。該試驗說明，隨著低氮處理，氮素高效利用文冠果植株脯氨酸含量明顯高于對照組，脯氨酸的增加很可能是補充氮素的一種逆境表現，有待于進一步挖掘機理。

4 結論

1) 該試驗篩選出8個氮素高效利用文冠果株系，為選育耐低氮新品種提供優質種質資源

2) 低氮處理條件下，氮素高效利用植株株高、莖粗和新梢長度顯著高于對照組(母樹)，凈光合速率大于對照組，植株長勢正常，維持正常生命活動。

3) 氮高效利用文冠果植株相比對照組具有更好的保護酶系統，具體表現為SOD、POD和脯氨酸持續不斷上升，而MDA基本保持不變。