膜莢黃芪IOMT基因的克隆及表達分析

胡仕婕， 趙 洋， 馮藝川， 李子羊， 全雪麗， 吳松權*

(1.延邊大學農學院，吉林 延吉 133002；2.百泰生物藥業有限公司，北京 100176)

黃芪(Radix Astragali)具有補氣固表、利尿消腫、托毒生肌之功效，在傳統中藥與臨床醫學中已被普遍應用，素有“十藥八芪”之稱[1]?，F代醫學研究表明，黃芪能夠預防感冒、肺結核盜汗、慢性肝炎、增加腎血流量、減輕腎損傷、增強機體耐缺氧及應激能力等癥[2-4]。其中，膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bunge)及其變種蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge var.mongholicus(Bunge)Hsiao)被確定為中藥黃芪，其他黃芪作為黃芪代用品或地方性用品[5-7]。芒柄花素(Formononetin)屬于甲基化的異黃酮類化合物，是黃芪最具活性的主要成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗心率不齊、抗菌、降血脂、改善動脈粥樣硬化病變和雌性激素樣作用等多種作用[8]。

膜莢黃芪是長白山區道地藥材之一，由于市場上對于膜莢黃芪需求的急劇增加，使得長白山區野生膜莢黃芪供不應求。雖然大規模的人工栽培黃芪使其得到了較好地補充，但栽培黃芪無論外觀品質還是成分含量均遠低于野生黃芪。異黃酮O-甲基轉移酶基因(Isoflavone O-methyltransferase，IOMT)屬于FOMT基因家族的一員，在毛蕊異黃酮葡萄糖苷生物合成中將甲基基團轉移到大豆苷元(Daidzein)生成芒柄花素，是其生物合成的關鍵基因。因此，該研究以長白山膜莢黃芪為試材，克隆AmIOMT基因的全長序列，探究其在膜莢黃芪不同組織中的表達特性，為分子水平上了解芒柄花素的生物合成機制和調控規律奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪藥材源自長白山區野生膜莢黃芪，經延邊大學農學院植物學教研室石鐵源教授鑒定為膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bunge。

植物材料的處理參見王樹斌等[9]的方法，種植于延邊大學農學院試驗基地。精確稱取根、莖、葉的新鮮部分0.5 g，各3份，液氮速凍后置于-70 ℃超低溫保存箱中保存，用于總RNA提取；另取根、莖、葉的新鮮部分0.5 g，各3份，于50 ℃烘干箱中烘干至恒重后磨粉，過60目篩，用于芒柄花素的提取。

1.2 方法

1.2.1 膜莢黃芪總RNA提取與反轉錄

膜莢黃芪總RNA的提取參照郎紅[10]方法，嚴格按照TRIzol試劑說明書所提供的步驟操作。將所得總RNA使用超微量紫外分光光度計測定吸光值，分析其純度及濃度；隨后將總RNA稀釋至濃度為500 ng/μL，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。以膜莢黃芪總RNA 500 ng/μL稀釋液為反轉錄模板，嚴格按照Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA擴增試劑盒說明書所提供的步驟反轉錄得到cDNA以及后續5′-RACE與3′-RACE擴增，過程擴增產物貯存于-80 ℃超低溫冰箱中。

1.2.2 膜莢黃芪AmIOMT基因全長克隆

登錄NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在GeneBank數據庫中下載已登錄的擬南芥或者大豆、苜蓿等豆科模式植物甲基轉移酶與糖基轉移酶基因的核酸序列，用MEGA 6軟件對其進行多重序列比對，分析并確定其保守區域；使用Primer Premier5.1軟件設計簡并引物AmIOMT ju1和AmIOMT jd1(表1)并擴增。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1) 擴增體系 cDNA1.0 μL、10×PCR buffer 2.0 μL、dNTP Mix (2.5 mmol/L) 2.0 μL、Ex Taq(2.5 U/μL) 0.4 μL、2.0 μmol/L引物各2.0 μL, 終體積為20.0 μL。

2) 反應條件 94 ℃預變性5 min; 然后進行35個循環, 94 ℃ 40 s,52 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min 30 s, 程序循環結束后72 ℃延伸反應10 min。

依據擴增測序結果設計5′-RACE擴增特異引物AmIOMT gsp1與3′-RACE擴增特異引物AmIOMT gsp2(表1)，并進行5′-RACE與3′-RACE擴增；依據已克隆的AmIOMT基因的保守序列及5′-RACE和3′-RACE產物序列，利用DNAStar軟件進行序列拼接，了解目的基因cDNA全長序列信息，并以此為依據設計了CDS特異引物AmIOMT cu1與AmIOMT cd1(表1)擴增AmIOMT基因的ORF，驗證目的基因的編碼序列。所有過程PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳后使用E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit進行回收，連接到PMD-18T載體，再轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，選取陽性克隆菌株送測序。

1.2.3膜莢黃芪AmIOMT基因的生物信息學分析

NCBI網站進行Blast同源性搜索分析；編碼蛋白等電點和分子量預測采用ExPasy在線軟件(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)；疏水性運用ExPASy ProtScale在線軟件(http://expasy.org/tools/protscale.html)；亞細胞定位情況分別用TargetP1.1(http://cbs.dtu.dk/services/TargetP)預測；蛋白質二級結構、三級結構預測分別使用PBIL LYON-GERLANG數據庫和Swiss-Model (http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html)在線工具完成；利用MEGA 6軟件構建系統發育進化樹，分析其在不同物種間的進化關系。

1.2.4 膜莢黃芪AmIOMT基因的表達量分析

1.2.4.1 膜莢黃芪不同時期總RNA的提取與cDNA的合成

具體方法參照2.1步驟，對膜莢黃芪不同部位樣品進行總RNA的提取與cDNA的合成，稀釋1倍后保存于-20℃冰箱中待用。

1.2.4.2AmIOMT基因標準曲線的建立

1) 用超微量紫外分光光度計測定所得AmIOMT的CDS質粒濃度，并根據以下公式計算其拷貝數：

拷貝數/copy·μL-1=樣品濃度/ng·μL-1/樣品分子量×6.02E+14

2) 將質粒原液10×等梯度稀釋至不同濃度，用作模板實時熒光定量PCR，每個樣品重復6次。具體反應體系為：SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL、ROX Reference Dye 0.5 μL、cDNA 2.0 μL、Premix (2.0 μM) 2.0 μL，終體積20.0 μL。

3) 將實時熒光定量PCR所得Ct值為縱坐標，以相應的質粒濃度為橫坐標，構建質粒標準曲線。

1.2.4.3 18 s內參基因標準曲線的建立與模板定量

1) 18 s內參基因標準曲線的建立

以2.4.1步驟所得膜莢黃芪cDNA為模板，通過PCR克隆18s內參基因(表1)，標準曲線的繪制方法具體參照2.4.2步驟。

2) 18 s內參基因模板定量

以2.4.1步驟中制備的cDNA為模板，用18 s定量引物(表1)對不同部位的樣品進行實時熒光定量PCR，所得Ct值通過18 s標準曲線計算拷貝數，即為18 s內參基因的表達量。

1.2.4.4AmIOMT基因在膜莢黃芪不同器官中表達量分析

以2.4.1步驟中制備的cDNA為模板，使用AmIOMT定量引物(表1)，進行實時熒光定量PCR，將基因在不同時期未知樣品所得Ct值代入相應的標準曲線計算出拷貝數。最終拷貝數與18 s內參基因表達量的比值即基因的表達量，每個樣品重復4次。

1.2.5 膜莢黃芪芒柄花素含量的測定

膜莢黃芪不同部位芒柄花素的提取采用 HPLC 法[11]對膜莢黃芪根、莖和葉等樣品進行測定，重復 3 次。

1.2.6 統計分析

利用SPSS 19.0軟件進行數據的統計分析，個體差異利用Duncan多范圍檢驗進行評估(P<0.05)用標準差來代表誤差。

2 結果與分析

2.1 膜莢黃芪AmIOMT基因克隆及序列分析

以膜莢黃芪cDNA為模板，使用簡并引物AmIOMT ju1與AmIOMT jd1擴增AmIOMT基因的保守區，經切膠回收、T載體連接、轉化至大腸桿菌JM109菌株后，獲得重組質粒，并對其進行鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1(A和B)所示。AmIOMT基因保守區目的片段長度為400 bp左右，測序結果顯示，AmIOMT基因保守區目的片段長度為417 bp。

登錄NCBI主頁(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，使用Blast在線搜索工具，將所得的AmIOMT保守區目的片段與其他植物的基因序列進行同源性比較。結果顯示：AmIOMT保守區目的片段與豆科植物紅豆草(HM204486)、蒺藜苜蓿(DQ419911)和大豆(KM012508.1)基因的一致性分別為86%、85%和85%；故初步認為所克隆的AmIOMT保守區目的片段為膜莢黃芪IOMT基因片段。

使用膜莢黃芪總RNA反轉錄合成第1條鏈，使用表1示出的特異引物AmIOMT gsp1、AmIOMT gsp2以及引物UPM(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)分別進行5′-RACE和3′RACE擴增，并進行質粒PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1(C、D、E和F)所示，可見鑒定結果與PCR產物一致，可將菌液保存并測序。測序結果顯示，AmIOMT5′端序列長度為1 050 bp，同源性搜索表明，該序列與豆科植物紅豆草(HM204486)、甘草(AB091685)、紫花苜蓿(MSAF000976)和蒺藜苜蓿(AY942159.1)的序列一致性分別為83%、82%、79%和79%；AmIOMT3′端序列長度為477 bp，該序列與豆科植物紅豆草(HM204486)、甘草(AB091685)、紫花苜蓿(MSAF000976)和蒺藜苜蓿(AY942159.1)的序列一致性分別為85%、83%、82%和84%。因此，初步認定AmIOMT5′端與AmIOMT-3′端分別為膜莢黃芪IOMT基因的5′端和3′端。

依據測序所得AmIOMT基因保守區域以及5′-RACE和3′-RACE序列，通過DNAStar軟件拼接獲得AmIOMT基因的全長序列，利用Primer 5 軟件設計1對編碼區特異引物(表1)。以1.2.1步驟所得cDNA第1條鏈為模板，通過PCR擴增獲取目的基因片段，經過回收、連接、轉化、提取質粒后進行PCR鑒定，結果如圖1(G和H)所示。因此，PCR鑒定與拼接所得序列一致，故確定AmIOMT基因的全長序列。

M:DL 2 000 Marker 1：目的條帶圖1 RACE法克隆AmUCGT基因電泳及PCR檢測圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of AmIOMT cloning by RACE

利用DNAStar序列分析軟件和NCBI網站的 ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)，ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)等在線分析工具分析AmIOMT全長cDNA序列。結果顯示(圖2)，AmIOMT序列全長1 213 bp，其中，開放閱讀框(ORF)1 089 bp，預測其編碼362個氨基酸多肽，此外，包含5′非翻譯區(5′-UTR)為54 bp，3′非翻譯區(3′-UTR)為70 bp(含24 bp的polyA尾)；A+T的含量為65.2%，G+C的含量為34.8%。登錄NCBI使用Blast在線搜索工具，將所得的膜莢黃芪IOMT基因序列其他植物的基因序列進行同源性比較。結果表明，AmIOMT與豆科植物紫花苜蓿(AF023481.1)、蒺藜苜蓿(AY942159.1)、紅豆草(HM204486.1)以及大豆(AB091685.1)的序列一致性分別為85%、84%、83%和82%。此外，與其他豆科植物的一致性也很高，初步說明該研究所克隆的AmIOMT是膜莢黃芪的甲基轉移酶序列。

圖2 AmIOMT基因全長及推導的氨基酸序列Fig.2 The full length sequence and deduced amino acid sequences of AmIOMT

2.2 膜莢黃芪AmIOMT基因的生物信息學分析

利用ExPASy ProtParam在線分析工具預測AmIOMT蛋白質的分子式為C1821H2881N461O548S20，蛋白分子量(MW)為40.64 kDa，所有氨基酸殘基中，Leu(11.0%)、Ile(8.3%)、Glu(8.3%)和Lys(8.0%)頻率較高；理論等電點(pI)為4.95，帶負電荷殘基數54，帶正電荷殘基數35，表明該蛋白呈酸性狀態；不穩定系數36.60，屬穩定性蛋白；親水性均值-0.052，屬親水性蛋白。

使用PRABI在線分析軟件與Swiss-Model Workspace在線工具預測AmIOMT二級結構與三級結構，結果表明，AmIOMT蛋白二級結構主要包括α螺旋174個，無規則卷曲137個以及鏈延伸區51個，分別占據47.93%、37.74%和14.05%，與三級結構的預測結果基本一致；對保守域分析表明，該蛋白存在IOMT受體結合域(又稱類黃酮底物結合域)和供體結合域(SAM結構域)。采用TMHMM 2.0在線分析軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行跨膜結構預測分析結果顯示，AmIOMT蛋白不存在跨膜區域，是非跨膜蛋白。

2.3 膜莢黃芪AmIOMT基因的系統進化分析

進一步深入研究AmIOMT與其他物種中甲基轉移酶的進化關系，通過MEGA6軟件利用最大近鄰法構建系統進化樹(圖3)。系統發育進化樹將所選取不同物種的甲基轉移酶分為3組，在圖中分別以組I、II、III示出。其中，組I中成員已被鑒定具有異黃酮7-O甲基轉移酶或類似活性，組Ⅱ中已被鑒定具有異黃酮4’-O甲基轉移酶或類似活性，組Ⅲ代表其他類別的甲基轉移酶。AmIOMT在組I中與豆科植物甘草中GeD7OMT與紅豆草中OvIOMT聚為一組，GeD7OMT與OvIOMT已均為已知功能的異黃酮甲基轉移酶，初步表明所鑒定的AmIOMT具有異黃酮7-O甲基化的能力。

注：GeneBank登錄號：MsI7OMT8(紫花苜蓿，O24529.1)；MsI7OMT9(紫花苜蓿，O22309.1)；MsI7OMT6(紫花苜蓿，O22308.1)；MtIOMT1(蒺藜苜蓿，XP_003621488.2)；CaI7OMT9(鷹嘴豆，XP_004489528.1)；GeD7OMT(甘草，Q84KK5.1)；OvIOMT(紅豆草，AEF14418.1)；MtIOMT6(蒺藜苜蓿，XP_013455257.1)；VrI4OMT(綠豆，XP_014524149.1)；GeHI4OMT(甘草，Q84KK6.1)；MtIOMT5(蒺藜苜蓿，XP_013456930.1)；PsHMM1(豌豆，O24305.1)；CaCCOMT(鷹嘴豆，XP_004505242.1)；MsCOMT(紫花苜蓿，Q40313.1)；MsCCOMT(紫花苜蓿，XP_003607927.1)；MfCCOMT(黃花苜蓿，AEW26114.1)圖3 植物甲基轉移酶基因的系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of plant O-methyltransferase genes

2.4 AmIOMT在膜莢黃芪不同器官的差異表達

利用實時熒光定量PCR評估AmIOMT在膜莢黃芪不同器官中的表達(圖4)，結果表明，AmIOMT在膜莢黃芪的根、莖和葉中均表達且達到了顯著水平。其中，葉中AmIOMT表達量最高，是根中表達量的23.1倍，而莖中AmIOMT的表達量為根中表達量的9.4倍，而通過HPLC法測定膜莢黃芪不同器官中芒柄花素含量結果(圖4)表明：葉中含量是根中含量(0.012 mg/g)的12.1倍，達到0.146 mg/g；莖中含量為0.084 mg/g，是根的7.0倍。

圖4 不同器官中AmIOMT基因的表達與芒柄花素含量Fig.4 Expression levels of AmIOMT and formononetin contents in different organs of A.membrananceus

3 討論與結論

芒柄花素是黃芪主要藥用成分之一[8]，但對作為芒柄花素生物合成中的關鍵結構基因IOMT的相關報道較少。該研究成功從長白山區膜莢黃芪根中克隆了AmIOMT基因的cDNA序列，全長1 213 bp，包含1 089 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼362個氨基酸多肽，為可溶性蛋白，定位于細胞質中。這與前人研究認為在自然界中，黃酮類化合物廣泛存在的一類多酚化合物[12]，具有極高的藥用價值[13]。通常在細胞質中合成，其生物合成相關基因以多酶復合體的形式存在于細胞質中[14]結果一致。系統進化分析表明，AmIOMT在與豆科植物甘草中GeD7OMT與紅豆草中OvIOMT聚為一組，GeD7OMT與OvIOMT已均為已知功能的7-O異黃酮甲基轉移酶，Akashi等[15]報道了GeD7OMT涉及芒柄花素(Formononetin)的生物合成，Thill等[16]則報道OvIOMT可以在7-O位置甲基化異黃酮。結構域預測表明，克隆的AmIOMT具備甲基轉移酶典型的結構特征和生物特性，即已成功克隆得到的AmIOMT基因全長cDNA序列具備7-O甲基基團轉移到大豆苷元生成芒柄花素的能力。

植物次生代謝產物受基因、轉錄、蛋白質水平等方面因素的綜合調控[8]。植物次生代謝產物的積累通常與其生物合成途徑基因的表達密切相關。因此，為了進一步明確膜莢黃芪AmIOMT基因與芒柄花素生物合成的分子機制，利用實時熒光定量PCR技術評估了AmIOMT基因在膜莢黃芪不同器官中的表達量與芒柄花素含量之間的關系。經過分析，AmIOMT基因在膜莢黃芪各個器官中的表達與芒柄花素含量之間均表達均，呈逐步升高的折線趨勢(圖4)，即均為葉>莖>根，說明芒柄花素的生物合成可能直接受到AmIOMT基因的調控。但黃酮類的生物合成是極其復雜的網絡系統，通常受到多種因素的綜合誘導和影響，而其在翻譯后蛋白質水平的調控尚不明確，需要進一步的深入研究。