金線蓮不同植物材料提取物抗氧化能力的綜合評價研究

孫佳玉， 趙成日， 范明智， 劉懿萱， 徐亞男， 金美玉

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

金線蓮(Anoectochilusroxburghii(Wall.) Lindl)為蘭科、開唇蘭屬植物，是一種民間常用的多年生名貴藥材，又名“藥王”、“神藥”、“金線入骨消”等[1]。金線蓮可整體入藥，可治療肺熱咳血、小兒驚風、風濕痹痛、糖尿病、膀胱黏膜下纖維化、支氣管炎等病癥。然而，目前野生金線蓮因過度開采，資源破壞嚴重；人工栽培雖然有多種繁殖方式，但因天然環境下植物生長速度慢，生產量難以滿足市場需求。因此，通過植物組織培養方式，快速培養組培材料被認為是獲取金線蓮植物原材料的一種有效途徑[2]。研究表明金線蓮中含有多種有效成分，如金線蓮苷、黃酮類、多糖、酚類、生物堿等[3]，其中的黃酮是重要的抗氧化物質，它可以有效清除體內的氧自由基，從而阻止細胞的退化、衰老[4]。體外抗氧化活性的評價方法有多種，以一種方法的評價結果很難真實地判斷物質的抗氧化能力[5]。因此，研究者常常利用多種方法進行評價，以期更加全面、客觀的評價待測物的抗氧化能力。然而，在抗氧化能力評價過程中時常出現方法間結果不一致的現象，這給研究者進行正確判斷帶來了困難。

層次分析法是一種定性和定量相結合分析的一種決策方法，于70年代由美國運籌學家、匹茲堡大學教授Saaty提出[6]。它的基本原理是把系統中各類因素劃分為相互關聯的有序層次，將復雜問題簡單化、條理化，依據對一定客觀事實的判斷就每一層次的相對重要性給予定量表示，利用數學方法確切表達每一層次全部元素相對重要性次序的權值，并通過排序結果分析和解決[7]。因此，該研究利用層次分析法對3種抗氧化活性評價方法的結果進行分析，旨在綜合評價金線蓮不同材料提取物的抗氧化能力。

在該研究中，以金線蓮天然植株、組培苗和根狀莖為試驗材料，研究了3種材料提取物的鐵離子螯合能力和DPPH及ABTS自由基清除活性，進而以3種評價方法中提取物的半最大效應濃度(EC50)為指標，利用層次分析法對不同金線蓮材料的抗氧化能力進行了綜合評價，為抗氧化相關產品的生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料包括金線蓮天然植株、組培苗和組培根狀莖。金線蓮天然植株干品來自福建省；組培苗和根狀莖分別參照曹天旭[8]和田文[2]的方法培養，培養30 d后收獲，用自來水沖洗，瀝干表面水分后烘干，其干品作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制備

取金線蓮不同植物材料干品2 g，置于150 mL三角燒瓶內，用80%甲醇，按照1∶30的料液比50 ℃下超聲提取(40 kHz)1 h后過濾，并收集濾液和濾渣。濾渣按上述方法提取3次，合并濾液。濾液進行真空濃縮，濃縮后的膏狀物于烘干箱中，45 ℃下干燥至恒重，既得提取物，于冷凍保存[9]。

1.2.2 鐵離子螯合能力的測定

參照Fu等[10]的方法稍作改進。將提取物用去離子水稀釋成不同濃度(1.25、2.5、5.0、10.0、15.0和20.0 mg/mL)，以檸檬酸(天津市科密歐化學試劑有限公司，中國)作為陽性對照。分別取50 μL待測樣品溶液，137.5 μL的蒸餾水、2.5 μL的FeCl2(sigma公司，美國)溶液和10 μL的ferrozine(sigma公司，美國)溶液于96孔板中，室溫下靜置10 min，為樣品組(A樣品)。將上述樣品組中的FeCl2溶液用等體積的蒸餾水(2.5 μL)代替即為對照組(A對照)，而待測樣品溶液用等體積蒸餾水(50 μL)即為空白組(A空白)。用酶標儀(iMark酶標儀，Bio-Rad，美國)在562 nm處測各反應液的吸光值(OD)，計算出鐵離子螯合能力，并根據不同濃度提取物的清除能力計算得到半數抑制濃度(EC50)。

1.2.3 清除DPPH自由基活性的測定

參照Sarikurkcu[11]的方法測定提取物清除DPPH自由基的能力。將提取物用去離子水稀釋為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL，以Vc(天津市科密歐化學試劑有限公司，中國)作為陽性對照。稱取3.9 mg的DPPH，用甲醇溶解并定容至100 mL，既得DPPH溶液(0.1 mM)。試管中分別加入2 mL待測樣品溶液和DPPH溶液，為樣品組(A樣品)。空白組(A空白)用2 mL甲醇代替樣品溶液。避光靜置30 min后，用紫外分光光度計在517 nm下測定OD值，計算DPPH自由基清除率，并根據不同濃度提取物的清除能力計算得到EC50值。

1.2.4 清除ABTS自由基活性測定

參照Garzon等[12]的方法測定ABTS自由基清除率。用去離子水配制ABTS溶液(ABTS 7 mmol/L+K2S2O82.45 mmol/L)，室溫下避光靜置16 h后，將混合液的OD值(734 nm)調節為0.7。將提取物用去離子水稀釋為0.25、0.5、1.0、2.0和4.0 mg/mL，以VC為陽性對照。取0.1 mL待測樣品和3.9 mL ABTS溶液于試管；對照組為0.1 mL待測樣品溶液和3.9 mL去離子水；空白組為0.1 mL甲醇溶液和3.9 mL的 ABTS溶液。混合液搖勻后靜置6 min，用紫外分光光度計于734 nm下測得OD值，計算ABTS自由基清除率，并根據不同濃度提取物的清除能力計算得到EC50。

1.3 抗氧化能力的綜合評價

以鐵離子螯合能力、DPPH和ABTS自由基清除的EC50，采用層次分析法綜合評價3種不同材料提取物抗氧化能力。根據Jensen[13]方法進行層次分析，結構模型由目標層(抗氧化能力綜合能力)和標準層(3種抗氧化能力評價的EC50)構成(圖1)。根據兩兩成對評價指標的相對重要性，賦予分值，以此構建成對比較矩陣，計算出各評價指標的權重，計算得到矩陣的最大特征值，進而得到成對矩陣的一致性比率。最后，根據標準化的權重計算出EC50的綜合評分。

圖1 層次分析的結構模型Fig.1 Structural model of analytic hierarchy process

1.4 數據分析

數據為重復3次的平均數，利用SPSS 22.0(Statistical Product and Service Solutions 22.0)方差分析，并進行鄧肯氏新復極差比較，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 金線蓮不同材料提取物鐵離子螯合能力比較

天然植株、組培苗和根狀莖具有不同程度的鐵離子螯合能力，隨提取物濃度的增加而提高。由圖2可知，天然植株和組培苗提取物的鐵離子螯合能力低于陽性對照(檸檬酸)，但根狀莖提取物高于陽性對照。當根狀莖提取物濃度為20 mg/mL時，鐵離子螯合能力達到85.5%，而陽性對照只為69%。

圖2 金線蓮天然植株、組培苗和根狀莖提取物的鐵離子螯合能力Fig.2 Chelating abilities of extracts from natural plants, in vitro shoots and rhizomes of Anoectochilus roxburghii

2.2 DPPH自由基清除率比較

3種材料的提取物濃度對DPPH自由基清除率影響的趨勢與鐵離子螯合能力相似，呈現濃度依賴性(圖3)。雖然3種材料的DPPH自由基清除活性均低于陽性對照，但提取物濃度為1 mg/mL時，根狀莖提取物的清除率達到了79.7%，組培苗為66%(圖3B)，天然植株為58.67%(圖3C)，說明此濃度下的根狀莖對DPPH的清除能力最強，其次是組培苗(圖3B)。

圖3 金線蓮天然植株、組培苗和根狀莖提取物的DPPH自由基清除率Fig.3 DPPH radical scavenging abilities of extracts from natural plants, in vitro shoots and rhizomes of Anoectochilus roxburghii

2.3 ABTS自由基清除率比較

由圖4可知，ABTS清除率隨提取物濃度的增加呈緩慢增加的趨勢。3種提取物的ABTS清除率均低于陽性對照(Vc)，但當組培苗提取物濃度達到4.0 mg/mL時，ABTS自由基清除率達到59.09%，高于天然植株和根狀莖提取物(圖4)。

圖4 金線蓮天然植株、組培苗和根狀莖提取物的ABTS自由基清除率Fig.4 ABTS radical scavenging abilities of extracts from natural plants, in vitro shoots and rhizomes of Anoectochilus roxburghii

2.4 3種材料提取物抗氧化能力綜合評價

不同材料提取物的抗氧化能力在不同評價體系中存在差異，根據上述試驗得到根狀莖提取物鐵離子螯合能力的EC50值最低，但組培苗提取物清除DPPH和ABTS自由基能力的EC50值最低(圖5)。為了選出最優抗氧化材料，該研究利用層次分析法，以3種抗氧化評價方法的EC50為指標對3種提取物進行綜合評價，以綜合評分最低為抗氧化能力最佳。

圖5 金線蓮天然植株、組培苗和根狀莖提取物的鐵離子螯合能力和DPPH及ABTS自由基清除率的半最大效應濃度Fig.5 Concentration for 50% of maximal effect in chelating ability and rates of DPPH and ABTS radical scavenging of extracts from natural plants, in vitro shoots and rhizomes of Anoectochilus roxburghii

該研究所構建的模型包括目標層(抗氧化能力綜合評價)和標準層[鐵離子螯合能力EC50(f1)、DPPH自由基清除率EC50(f2)和ABTS自由基清除率EC50(f3)]。表1為通過系列分析和計算得到的各參數[14]。具體過程為：通過比較f1和f2(f1/f2)、f1和f3(f1/f3)、f2和f3(f2/f3)的相對重要性(表2)[15]，賦予對比分值，得到抗氧化評價指標的成對矩陣(N)。

表1 層次分析結構模型中成對比較矩陣及各指標權重Table 1 Paired comparison matrix and the weight of each indicator in the analytic hierarchy model

表2 不同提取物對抗氧化能力的各層次評分標準Table 2 Value meaning of the nine-scale method

表3 隨機矩陣的平均一致性列表Table 3 Average consistencies of random matrices

圖6 金線蓮天然植株、組培苗和根狀莖提取物抗氧化能力綜合評價結果Fig.6 Comprehensive evaluation result of antioxidant abilities of extracts from natural plants,in vitro shoots and and rhizomes of Anoectochilus roxburghii

3 討論與結論

氧化會使細胞和組織分解，影響代謝功能，加速衰老并引發疾病。與化學合成藥劑相比，天然植株提取物具有毒副作用小、安全性高等優點，可作為天然抗氧化劑。目前研究表明，冬瓜皮[17]、虎舌紅[18]、黃秋葵果皮[19]等許多天然植物材料均具有較強的抗氧化活性；金線蓮的抗氧化活性也得以證明，如林麗清[20]等發現，金線蓮多糖對氧自由基具有較強的清除作用，其活性也與劑量呈正相關。但關于金線蓮培養材料的抗氧化作用鮮有報道。因此，該研究對金線蓮組培苗和根狀莖的抗氧化活性與其天然植株進行了比較，發現2種組培材料提取物的鐵離子螯合能力、DPPH和ABTS自由基清除率高于天然植株，說明金線蓮培養物作為抗氧化產品的原材料具有可行性。

另外，在對物質的抗氧化能力評價時，多種評價方法往往使研究人員難以做出綜合評價，從而影響適宜材料的選擇。因此，利用多個指標組成的評價系統，通過計算權重進行綜合評估可以解決這一難題。層次分析法是對一些較為復雜、模糊的問題，通過構建有序的階梯層次模型，最終確立層次判斷矩陣中各指標的權重的綜合評價方法[21]。層次分析法在客觀上提高了評價結果的有效性、可靠性和可行性。這種方法在經濟與計劃、能源政策與資源分配、環境工程、軍事指揮與武器評價等領域廣為應用，現也在中藥提取等領域作為綜合評價工藝體系而應用[22-24]。該研究將層次分析法用在金線蓮提取物的抗氧化能力綜合評價上，解決了3種評價結果不同難以判斷最優材料的困難。該研究根據綜合評分最終得到根狀莖抗氧化能力高于組培苗和天然植株的結論，為今后產品生產提供了依據。