人工誘導的不同倍性藍靛果植物學性狀及活性成分含量比較研究

盛煜鈞， 陳 宇， 元慶浩， 梁相鎭， 曹后男*， 宗成文

(1.延邊大學農學院，吉林 延吉 133000；2.韓國農業振興廳園藝特作研究院,韓國 羅州 520-010)

藍靛果(LoniceraedulisTurcz.)又名山茄子、羊奶子、黑瞎子果等[1]，是忍冬科、忍冬屬多年生落葉小灌木。藍靛果是一種可食用的野生漿果類植物，果實成熟期在6～7月中旬[2]，屬中生植物，喜濕，抗寒性和抗霜能力極高，可忍受-50 ℃以下低溫[3]。藍靛果野生資源主要分布在日本、俄羅斯、朝鮮、中國、北美等國家[4]，在我國主要分布在華北、西北、東北、西南和內蒙等地區，汪清及和龍等地區是延邊藍靛果的主產區。藍靛果中含有豐富的營養物質，含10%～17%的干物質[4]，此外，還富含多酚、黃酮、花色苷、花青甙、蕓香甙、兒茶酸等[5]對人類健康有益的活性物質，具有較高的食用價值。

自然環境下生長的許多重要作物多是二倍體，育種學家自30年代開始就熱衷于多倍體誘導育種的研究，隨著對多倍體產生途徑、特征特性及鑒定方法等方面更為深入的研究，多倍體誘導育種在育種領域顯示出日益廣闊的發展前景[6]。關于藍靛果的倍性研究，俄羅斯學者Plekhanova[7]及國內學者霍俊偉等[8]研究發現，俄羅斯野生藍靛果中既有二倍體又有四倍體。長白山地區的野生藍靛果果實單果重小，果味酸甜微澀，帶有輕微苦味[9]。多倍體植株的表型特征是莖粗、葉大、花大、果實大，果實巨大性是多倍體最為顯著的外部形態特征，相對應植株所含糖類和蛋白質等營養物質的含量都有所增加，因此，選育多倍體藍靛果對改善野生藍靛果品質具有重要意義。該試驗以二倍體、四倍體、八倍體藍靛果組培苗及大田苗為試材，測定分析了藍靛果植物學性狀差異、葉片的生理活性成分含量差異及細胞學差異，為早期選擇符合多倍體特征的藍靛果植株奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

二倍體藍靛果(從長白山野生藍靛果中篩選出的果大，豐產，無澀味，口感較甜的優良單株)及其人工誘導的四倍體和八倍體組培苗及1年生大田苗。

1.2 方法

1.2.1 植物學性狀觀察

選擇培養45 d的不同倍性藍靛果組培苗及其在田間生長1年的植株，用游標卡尺精準的測量其株高、莖粗、節間長、葉厚、葉長、葉寬。

1.2.2 葉片細胞學觀察

采摘藍靛果頂端第2、3層葉片，將其放入卡諾固定液中浸泡至葉片全部褪去綠色為止，立即用1N HCL解離4 min，具體可根據葉片老嫩程度，后用蒸餾水洗4 min，將葉片用1% I-KI染色液染色40 s，制作臨時裝片，在光學顯微鏡下觀察氣孔形態及葉綠體，每個樣品制作3個臨時裝片，每個裝片觀察10個視野并拍照，測量氣孔長和寬，記錄視野中氣孔數目、葉綠體數目。

1.2.3 葉片花青素、類黃酮及總酚測定方法

按照楊玲等[10]的測定方法，花青素在530 nm波長下測定吸光值，類黃酮在325 nm處測定，總酚在280 nm處測定，含量以mg/g表示。

1.2.4 葉片維生素C含量的測定

按照賈洪斌等[11]的測定方法，根據公式計算藍靛果葉片中VC含量。

式中,C為測定液中維生素C含量/mg;Vt為提取液總體積/mL;Vm為測定液體積/mL;W為樣品重/g。

1.2.5 葉綠素含量的測定

采用盛璐等[12]的測定方法，按照以下公式計算藍靛果葉片中葉綠素a(Ca)、葉綠素b(Cb)和總葉綠素含量(C總)。

C總=Ca+Cb

式中,A663為663 nm測定的吸光值;A645為645 nm測定的吸光值;V為測定液體積/mL;W為樣品重/g。

1.2.6 葉片氮素及葉色值的測定

采用植株養分速測儀(TYS-3N)測定藍靛果葉片中氮素含量及葉色值，選擇正常生長且沒有蟲食的健康葉片進行測定，每個葉片取不同位置進行測定，重復20次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 不同倍性藍靛果植物學性狀調查

不同倍性藍靛果組培苗生長狀態如圖1所示。

圖1 不同倍性藍靛果組培苗的生長狀態Fig.1 Growth status of invitro cultured plantlets of Lonicera edulis different ploidy

由表1可知，二倍體和四倍體的株高無顯著差異，八倍體株高顯著低于二倍體和四倍體；二倍體和四倍體組培苗表現為莖細、節間長，而八倍體組培苗則表現為莖粗且節間短，莖粗和節間長與二倍體和四倍體組培苗存在顯著差異；二倍體和四倍體的葉片長度顯著高于八倍體，葉寬與葉形指數沒有顯著差異(表1)，變幅表示所測樣本的范圍即樣本中最大值與最小值。

表1 不同倍性藍靛果組培苗植物學性狀調查Table 1 Botanical characters of invitro cultured plantlets of Lonicera edulis different ploidy

不同倍性藍靛果大田苗生長狀態如圖2所示。

圖2 不同倍性藍靛果大田苗的生長狀態Fig.2 Growth status of field-grown plants of Lonicera edulis different ploidy

由表2可知，不同倍性大田苗株高存在顯著差異，倍性增加，株高越小；二倍體莖粗和四倍體有差異但不顯著，二倍體與八倍體差異顯著；八倍體節間長與二倍體和四倍體存在顯著差異，四倍體與二倍體之間無顯著差異；不同倍性大田苗葉長無顯著差異，葉寬存在顯著差異，倍性增加，葉片越寬，葉形指數沒有顯著差異。

表2 不同倍性藍靛果大田苗植物學性狀調查Table 2 Botanical characters of field-grown plants of Lonicera edulis different ploidy

2.2 不同倍性藍靛果葉片氣孔數量、大小、密度及葉綠體數目

細胞學觀察結果如表3所示。試驗結果表明，不同倍性組培苗氣孔長度存在顯著差異，倍性增加，氣孔長度越大；在大田苗中二倍體與八倍體存在顯著差異，四倍體與八倍體差異顯著，四倍體與二倍體有差異但不顯著。八倍體葉片中氣孔寬度與四倍體、二倍體存在顯著差異，二倍體和四倍體之間差異不顯著，組培苗和大田苗趨勢一致。不同倍性組培苗藍靛果葉片氣孔中的葉綠體數存在顯著差異(圖3)，倍性增加，氣孔中的葉綠體數越多，組培苗和大田苗中趨勢一致。不同倍性大田苗氣孔密度存在顯著差異(圖4)，倍性增加，相同面積下的氣孔數越少，即氣孔密度越小。

表3 不同倍性藍靛果葉片氣孔大小、密度及葉綠體數目Table 3 Stomata size, stomata density and number of chloroplasts in leaves of Lonicera edulis different ploidy

圖3 不同倍性藍靛果組培苗氣孔葉綠體數目Fig.3 Chloroplast numbers of in vitro cultured plantles of Lonicera edulis different ploidy

圖4 不同倍性藍靛果大田苗葉片氣孔密度觀察(10×40)Fig.4 Leaf stomatal density of field-grown plants of Lonicera edulis different ploidy(10×40)

2.3 不同倍性藍靛果葉片生理活性成分含量

不同倍性藍靛果葉片生理活性成分含量如表4所示。葉片中花青素、類黃酮及總酚含量存在顯著差異，八倍體葉片中的含量顯著高于二倍體和四倍體，四倍體顯著高于二倍體。倍性增加，花青素、類黃酮和總酚的含量越高，大田苗與組培苗趨勢一致；而維生素C的含量是隨著倍性增加，逐漸降低，二倍體和八倍體之間存在顯著差異，二倍體和四倍體之間差異不顯著。

表4 不同倍性藍靛果葉片生理活性成分含量Table 4 Content of physiological active components in leaves of Lonicera edulis different ploidy (mg/g)

2.4 不同倍性藍靛果葉片葉綠素含量

藍靛果葉片葉綠素含量測定結果如表5所示。八倍體葉綠素a含量、葉綠素b含量與二倍體之間存在顯著差異，四倍體和二倍體差異不顯著但數值介于二倍體和八倍體之間，隨著倍性增加，葉片中葉綠素含量越高。不同倍性總葉綠素含量存在顯著差異，八倍體顯著高于四倍體和二倍體，四倍體顯著高于二倍體。葉綠素a和葉綠素b比值二倍體和八倍體之間存在顯著差異，四倍體與二倍體存在差異但差異不顯著。

2.5 不同倍性藍靛果葉色值及氮素值

不同倍性藍靛果葉片中葉色值存在顯著差異，倍性增加，葉色值越大，綠色越濃郁。二倍體和八倍體之間氮素含量差異顯著，四倍體與二倍體和八倍體差異不顯著，但介于二者之間，藍靛果葉片氮素含量與倍性存在一定的正相關關系。大田苗與組培苗趨勢一致(表6)。

表6 不同倍性藍靛果葉色值及氮素值Table 6 Leaf color value and nitrogen value of Lonicera edulis different ploidy

3 討論

大量研究結果表明，多倍體植株在其生長發育過程中一般呈現出巨大性，即植株體中細胞、組織和器官通常比其二倍體親本更大，營養物質隨著倍性增加而增加[13]。王同坤等[14]的研究表明，四倍體玫瑰香不僅保持了二倍體玫瑰香品種原有的色、香、味優點，還較其提前成熟7～10 d，果粒增大，生長勢、豐產性增強，抗病力略有增加。而長白山地區的野生藍靛果果實單果重小，果味酸甜微澀，帶有輕微苦味，因此，選育多倍體藍靛果對改善野生藍靛果品質具有重要意義。

程曉紊等[15]利用細胞學法對三倍體甜葉菊進行倍性鑒定的結果表明，在多倍體育種中，根據氣孔大小來鑒定倍性是一種常用的辦法，氣孔的變化可以作為鑒定多倍體的一個重要指標。該試驗中葉片氣孔特征表明，與二倍體相比八倍體的氣孔及其氣孔密度變小，體積變大，保衛細胞中葉綠體數量增多。不同倍性藍靛果大田苗植物學形狀差異顯著，試驗結果進一步表明，外部形態特征和葉片下表皮氣孔密度變小等氣孔特征可作為鑒定變異材料的間接方法。

多倍體特征除了細胞學差異外，該試驗研究發現，不同倍性藍靛果葉片中生理活性成分含量存在顯著差異，藍靛果葉片中花青素、類黃酮和總酚含量與倍性呈正相關關系，倍性越大，含量越高，而VC含量隨著倍性升高而減少。李建勛[16]的試驗結果表明，四倍體黑果腺肋花楸葉片中花青素、總酚和總黃酮含量微高于二倍體。姚宇[17]的研究表明，黑果枸杞葉片中花青素含量隨著倍性增加而增加，抗壞血酸隨著倍性增加而減少。與該試驗在藍靛果中得到的結果一致。鄭鋒等[18]的試驗結果表明，小型西瓜鮮果中VC含量倍性越高含量越高，但大多差異不顯著。謝國芳等[19]對金刺梨果實和葉片中VC含量測定顯示，果實中VC含量顯著高于葉片。相較于葉片測定而言，果實中VC含量會更具有典型性，由于沒有果實的材料無法進行驗證，果實中VC含量需要更進一步研究。該試驗加入植株養分速測儀用以測定葉片葉色值和氮素含量，在不損傷葉片的基礎上，對葉片的葉綠素、含氮量進行測定，得到結果是倍性越高，葉色值和含氮量越高。因此，在做多倍體研究時也可以根據生理活性成分含量進行早期檢測，為后期鑒定提供依據。

4 結論

組培苗植物學性狀調查結果表明，二倍體和四倍體組培苗表現為株高、莖細、節間長、葉薄、葉長，而八倍體組培苗則表現為植株矮、莖粗、節間短、葉厚、葉短，八倍體的莖粗和節間長與二倍體和四倍體組培苗存在顯著差異。大田苗植物學性狀調查結果表明倍性增加，株高越小、莖越粗、節間越短、葉片越厚、葉片越寬。不同倍性藍靛果葉片氣孔密度、氣孔中葉綠體數存在顯著差異，倍性越大，氣孔越大，氣孔密度越低，氣孔內葉綠體數量越多，組培苗和大田苗變化趨勢一致。生理活性成分含量測定結果表明，不同倍性藍靛果葉片中花青素、類黃酮及總酚含量存在顯著差異，倍性越大，含量越高；VC含量變化趨勢則相反，倍性增加，含量減少，二倍體與八倍體植株存在顯著差異。不同倍性藍靛果葉片總葉綠素含量存在顯著差異，倍性增加，葉色值越大，氮素含量越高，大田苗與組培苗趨勢一致。