蛹蟲草菌絲體蛋白高通量發酵生產技術研究*

劉廣建，鄭惠華，張 辰，蔣 益，薛 璟，桑 花，田貞樂，季宏更，張 蕾

（1.江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫214063；2.江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通226009）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）是麥角菌科（Clavicipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）真菌。蛹蟲草子實體蛋白質含量高，氨基酸種類齊全[1]；蛹蟲草蛋白中含有許多功能活性成分，如活性蛋白多肽、多糖肽等。食用菌活性蛋白具有提高人體免疫力、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗真菌等功效，藥用保健價值高[2-3]。目前食用菌蛋白的來源除了食用菌子實體蛋白，還可通過食用菌液體發酵獲得大量的菌絲體，并通過提純獲得菌絲蛋白。

蛹蟲草高通量發酵技術研究，主要是在菌絲快速生長階段，通過補料維持適宜的發酵條件，使菌絲持續快速生長。梁恒宇等[4]在產賴氨酸大腸桿菌工業化發酵生產L-賴氨酸的研究中，利用高通量生物反應器，以在線監測pH為直接反饋補料信號，以葡萄糖、氨水和硫酸銨混合溶液為流加液進行補料發酵生產賴氨酸，可使賴氨酸產量大幅提高。但此方式在蛹蟲草等大型食用菌液體發酵中還未見報道，而蛹蟲草高通量發酵可以在短時間內獲得大量質量穩定、安全可靠的蛹蟲草菌絲體蛋白，可作為蛋白質食品加工的來源。因此，試驗通過研究補料發酵中發酵液pH變化與還原糖消耗的關系，建立pH與還原糖的反饋信號，并進行分段補料發酵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

蛹蟲草菌株（SWAHcor-15003），江蘇省蘇微微生物研究有限公司通過常壓室溫等離子體（ARTP）誘變選育的高產菌絲體蛋白液體發酵菌株。

1.1.2 培養基

酵母膏 0.8%、蛋白胨 0.6%、葡萄糖 2.0%，MgSO40.05%、KH2PO40.10%，維生素 B110 mg·L-1。

1.1.3 補料液

每3.5升補料液，含濃氨水96 mL、葡萄糖1 200 g、酵母膏360 g。

1.1.4 主要儀器和試劑

HYL-A全溫搖瓶柜，江蘇太倉強樂實驗設備有限公司；200 L液體發酵罐，江蘇鎮江江工生物成套設備有限公司；紫外可見分光光度計，上海譜元儀器有限公司；KT260定氮儀，福斯賽若分析儀器有限公司；25.0%～28.0%氨水，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 液體發酵最佳培養基的研究

運用響應面分析法，試驗以酵母膏、蛋白胨、葡萄糖為發酵基礎培養液進行單因素發酵研究，在單因素分析的基礎上利用Box-Benhnken方法進行3因素3水平試驗設計，以菌絲體生物量為響應值，進行響應面分析得到優化組合條件，試驗數據使用Excel進行整理和繪圖，同時利用Design-Expert 8.0統計分析軟件進行多元二次回歸模型方程的建立及方差分析，運用該軟件中響應面值優化程序求得當響應面值最大時各因素的最佳組合。響應面試驗因素水平見表1。

表1 最佳培養基的響應面分析試驗因素水平Tab.1 Factors and levels of response surface analysis of the fittest medium

1.2.2 高通量液體發酵研究

1）未調控pH的蛹蟲草普通一段式液體發酵參數

試驗以500 mL搖瓶裝發酵液100 mL（響應面分析得到的最佳培養基）進行蛹蟲草菌絲液體發酵，培養溫度26℃，轉速150 r·min-1。考察不同時間段發酵液pH、還原糖，菌絲體生物量及菌絲生長速率變化。

2）調控pH的蛹蟲草高通量液體發酵參數研究

蛹蟲草菌絲的最適生長 pH 為 5.4～6.8[5]，試驗以500 mL搖瓶裝發酵液100 mL（響應面分析得到的最佳培養基）進行蛹蟲草菌絲液體發酵，根據不同時間段的pH，用濃氨水進行pH調控，將pH始終調控為5.8左右，考察不同時間還原糖、菌絲體生物量以及不同時間段的菌絲生長速率變化。

3）蛹蟲草高通量發酵的補料發酵研究

試驗以500 mL搖瓶裝發酵液100 mL（響應面分析得到的最佳培養基）進行蛹蟲草液體發酵，通過pH監控，在pH到達一定的值時加入補料液，其中濃氨水直接加入。試驗連續補料4次，考察還原糖、菌絲體生物量的變化，根據發酵液的濃稠程度調整搖床轉速，以找到蛹蟲草高通量液體發酵的最佳參數。

4）工業化蛹蟲草高通量補料發酵試驗

發酵試驗同時進行了工廠化普通一段式液體發酵和高通量補料發酵，考察2組發酵方式發酵情況。發酵罐（通氣加攪拌） 容積200 L，裝液量120 L，通氣量 1 ∶（0.5～1.0），壓差法接種，接種量為 8%，添加0.1%豆油作為消泡劑，25℃～26℃條件下培養。普通一段式液體發酵以攪拌轉速150 r·min-1發酵直至發酵結束；高通量補料發酵采用同樣發酵條件，開始時攪拌轉速150 r·min-1，根據發酵情況調整轉速，根據3） 搖瓶高通量發酵的最佳參數，進行工業化高通量補料發酵試驗，確定最佳發酵參數。

5）蛹蟲草菌絲體真蛋白檢測

工業化發酵的蛹蟲草菌絲體在離心、烘干后進行菌絲體蛋白測定時，因在補料發酵過程中使用了氨水，會使發酵液中含有許多銨鹽成分。試驗后菌絲體雖然進行了洗滌，但還是有可能吸附了一定量的銨鹽成分。直接凱氏定氮法檢測[6]，蛋白數值會偏高。試驗運用程淑華[7]真蛋白檢測方法進行菌絲體蛋白的測定，用氫氧化銅沉淀真蛋白，后用熱蒸餾水洗滌氨化含氮物，再用凱氏定氮法進行測定，連續3次重復測定。菌絲體蛋白含量（W，g·100-1mL-1）的計算公式如下：

式中：M為菌絲體生物量（g·100-1mL-1）；m為菌絲體蛋白得率（%）。

2 結果與分析

2.1 液體發酵最佳培養基的確定

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Benhnken設計原理，以葡萄糖、蛋白胨、酵母膏3個因素為自變量，以蛹蟲草菌絲體生物量為響應值，采用響應面法進行3因素3水平的試驗設計，共包括17組試驗方案，試驗設計方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Tab.2 Response surface test design scheme and results

利用設計軟件Design-Expert對表2數據進行多元回歸擬合，獲得二次多項回歸方程菌絲體生物量Y的計算公式：

式中：A為葡萄糖值、B蛋白胨值、C為酵母膏值。

回歸模型方程的ANOVA分析結果見表3。

表3 響應面試驗回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis of response surface test regression model

由表3可知，擬合方程具有較高的F值（F=76.03） 和非常低的P值（P<0.000 1） 說明回歸方程達到極顯著水平（P<0.0001，R2=0.971 5）；失擬項的P=0.939 3＞0.05，試驗數據與模型預測數據差異不顯著，表明該擬合方程與實際擬合較好。另外設計軟件Design-Expert得出試驗結果相關系數模型的決定系數R2為0.971 5，表明菌絲體生物量的試驗值與預測值有較好的一致性，調整決定系數R2adj為0.976 9，說明該模型能解釋97.69%響應值變化。該二次回歸模型擬合程度好，試驗誤差較小，可用該模型方程對液體發酵培養基最佳條件預測和分析。

由F值可以看出3個因素對菌絲體生物量的影響程度由大到小依次為葡萄糖（A） ＞酵母膏（C） ＞蛋白胨（B）；由響應面模型分析得出最佳的培養基參數為葡萄糖3.0%、蛋白胨0.4%、酵母膏1.0%，菌絲體生物量為1.644 0 g·100-1mL-1。

2.2 液體發酵參數試驗結果

不同時間段100 mL發酵液蛹蟲草菌絲生物量和菌絲生長速率的變化見圖1。

由圖1可看出，隨著時間的變化，菌絲體生物量不斷增加，但發酵末期生物量幾乎未有變化；調節發酵液pH組的生物量一直比未調節pH的高，如在48 h時生物量相差0.155 g，但后期120 h時生物量相差僅0.05 g，在144 h發酵結束時生物量分別為1.612 g·100-1mL-1、1.615 g·100-1mL-1幾乎相同，說明發酵過程中調節適宜pH可以加快菌絲生長，但若不補充碳氮營養，發酵后期會隨著碳氮營養的消耗，總生物量將不再發生變化。調節發酵液pH的蛹蟲草菌絲生長速率在0～72 h比未調節高，后期卻降低，說明需要補充碳氮營養，以提高菌絲的生物量；同時發現在整個發酵過程中，在48 h～72 h時間段蛹蟲草菌絲生長速率最高，調節pH和未調節pH分別達到 0.014 3 g·h-1、0.013 8 g·h-1。100 mL 發酵液補料時的pH及還原糖參數見圖2。

由圖2可看出，隨著時間的變化還原糖含量不斷減少，到后期幾乎未有變化。開始時發酵液的pH為5.22，100 mL發酵液加入40 μL濃氨水可調節pH到 5.80，48 h 后 pH 降至 4.15，加入氨水 80 μL 可調節 pH為5.80。在發酵開始時的還原糖為 30.49 mg·mL-1，調節pH和未調節pH的發酵液48 h時的還原糖含量分別為17.97 mg·mL-1、18.82 mg·mL-1，128 h時分別為 2.68 mg·mL-1、3.06 mg·mL-1，在 48 h 碳源營養消耗約1/3。

由圖2可看出，在48 h快速生長階段初期進行補料，這時對應的pH為4.10～4.20，發酵液還原糖在18 mg·mL-1左右，碳氮營養消耗1/3左右，因此在補料時考慮添加80 μL氨水調節pH和添加1/3的碳氮營養即100 mL發酵液添加1.0 g葡萄糖、0.3 g酵母膏，氨水可代替部分氮源。

2.3 蛹蟲草高通量發酵的補料發酵研究

在發酵參數研究的基礎上分別進行搖瓶及發酵罐補料發酵研究，發酵開始，搖瓶用40 μL氨水調節pH，發酵罐用50 mL氨水調節pH，pH在4.10～4.20，發酵液還原糖含量約18 mg·mL-1時進行補料，每次補料時調節pH為5.8；每次補料每瓶搖瓶加3 mL補料液，發酵罐加3.5 L補料液。開始搖床轉速150 r·min-1，第 2 次補料時轉速 180 r·min-1，第 4 次補料時轉速220 r·min-1，直至發酵結束。發酵罐開始攪拌時轉速180 r·min-1，第2次補料時轉速220 r·min-1，第 4 次補料時轉速 300 r·min-1，直至發酵結束。搖瓶補料發酵情況見表4。

表4 搖瓶補料發酵情況表Tab.4 Resuts of supplementary fermentation in shake-flask

由表4可看出，pH 在 4.10～4.20時，發酵液還原糖含量約18 mg·mL-1，說明發酵補料的時間點及補料的碳氮營養比例適宜，搖瓶發酵結束時菌絲體生物量為2.316 g·100-1mL-1，比未補料發酵菌絲體生物量 1.612 g·100-1mL-1提高了 43.8%，因此以該參數進行發酵罐的高通量補料發酵研究。200 L發酵罐補料發酵情況見表5。

表5 200 L發酵罐補料發酵情況Tab.5 Resuts of supplementary fermentation in 200 L fermentation tank

由表5發酵罐數據可知，搖瓶及發酵罐補料發酵的數據有一致性。在 pH 4.10～4.20，對應發酵液還原糖18 mg·mL-1左右時進行補料發酵，發酵69 h就可結束發酵，菌絲體生物量為2.362 g·100-1mL-1，達到了高通量發酵的理想結果。

2.4 蛹蟲草菌絲體真蛋白檢測

200 L發酵罐蛹蟲草發酵液，直接運用凱氏定氮法測定菌絲體蛋白得率達到51.43%。采用真蛋白檢測方法[7]，菌絲體蛋白質得率為46.5%。搖瓶及發酵罐一段發酵與補料發酵情況對照情況見表6。

表6 搖瓶及發酵罐一段發酵與補料發酵情況對照表Tab.6 Comparison of ordinary fermentation and supplementary fermentation in shake-flask and fermentation tank

由表6發酵數據可知，普通一段發酵主要考察發酵參數，了解菌絲生長狀況，為高通量發酵提供介入點，同時發酵參數又可作為高通量發酵的對照。200 L發酵罐工業化發酵生產高通量液體發酵，發酵時間69 h，比普通一段式發酵時間縮短3 h；菌絲體蛋白含量達到1.098 g·100-1mL-1，比普通一段式發酵菌絲體蛋白含量 （0.651 g·100-1mL-1）提高 68.92%[8]。

3 討論與結論

已有研究中，微生物可通過流加、分段補料等方式進行液體高通量發酵，均取得了理想的成果，梁恒宇等[4]的研究結果表明，在賴氨酸發酵的不同階段采用不同配比的流加液進行分段式培養可以進一步提高賴氨酸的產酸濃度，同時降低殘糖和殘銨氮含量。三段式pH反饋補料發酵可以將賴氨酸產酸濃度提高到 （56.85±0.98） g·L-1，與二段式和一段式相比分別提高8.65%和23.64%。項目組根據單位現有發酵條件，采用分段式高通量液體發酵方式進行了蛹蟲草的液體發酵研究。試驗通過響應面分析法得到了最佳培養基為葡萄糖3.0%、蛋白胨0.4%、酵母膏 1.0%，MgSO40.05%、KH2PO40.10%、維生素 B110 mg·L-1。通過蛹蟲草高通量發酵研究得到最佳發酵參數為200 L發酵罐每次補液量3.5 L（包含濃氨水96 mL、葡萄糖1 200 g、酵母膏360 g），在38 h、42 h、48 h、54 h進行4次補料，整個發酵結束時間 69 h，菌絲體生物量 2.36 g·100-1mL-1，菌絲體蛋白得率 46.5%，菌絲體蛋白含量 1.098 g·100-1mL-1，比普通發酵菌絲體蛋白含量提高68.92%。

蛹蟲草SWAHcor-15003誘變高蛋白菌株在普通一段式發酵菌絲體蛋白得率為40.9%[8]，而通過補料進行的高通量發酵后蛋白含量有一定的增加，說明在發酵過程通過添加氨水調節pH及補料發酵可提高發酵產物蛋白質含量；通過對pH、還原糖等一些發酵參數的實時監控，以pH及還原糖為反饋數據進行食用菌高通量液體發酵的方式證明可行，后續可進行食用菌流加補料高通量發酵的相關研究。