榆黃蘑不同生長發(fā)育期胞外酶活性變化研究*

雷 萍，吳亞召，張文雋，馬婧嘉，賈 靜，馬 瑩

（1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2.陜西崇德生物技術(shù)發(fā)展有限公司，陜西 高陵 710200）

榆黃蘑（Pleurotus citrinipileatus Sing.）隸屬于擔(dān)子菌綱 （Basidiomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 側(cè)耳科（Pleurotaceae） 側(cè)耳屬（Pleurotus），又名金頂側(cè)耳、金頂蘑等[1]。榆黃蘑味道鮮美、香味濃郁、營養(yǎng)豐富，其干品子實體含粗蛋白41.5%、粗脂肪3.8%、粗纖維 8.4%，總氨基酸 28.65%，人體必需的8種氨基酸含量豐富，也含有Fe、Zn、Se、P、K等微量元素，是高蛋白、低脂肪的綠色保健食品[2]。榆黃蘑藥用價值極高，具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、降血脂、保肝護肝等藥理功能[3-4]。

20世紀(jì)70年代我國開始進行榆黃蘑人工栽培試驗，近年來栽培面積不斷擴大，在全國范圍內(nèi)已形成一定的規(guī)模。榆黃蘑栽培原料主要為闊葉樹木屑或農(nóng)作物秸稈，生長發(fā)育過程中需要將培養(yǎng)基中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等大分子物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)，以供菌絲吸收利用[5]。而對這些大分子物質(zhì)進行降解轉(zhuǎn)化的是菌絲分泌的各種胞外酶，主要包括纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶等。研究不同生長階段胞外酶的分泌特點、活性大小以及動態(tài)變化趨勢，可推測出生產(chǎn)發(fā)育過程中不同階段培養(yǎng)基中木質(zhì)纖維素、淀粉等營養(yǎng)成分的降解動態(tài)，從而為選擇優(yōu)良菌株、優(yōu)化栽培培養(yǎng)基和栽培管理條件提供一定的試驗依據(jù)[6]。以棉籽殼、木屑為主要栽培培養(yǎng)料，對榆黃蘑栽培過程不同生長期分泌的7種胞外酶活性進行測定，以了解其胞外酶變化規(guī)律，推測不同發(fā)育階段的營養(yǎng)生理需求，為榆黃蘑高產(chǎn)菌種選育和人工高產(chǎn)栽培提供科學(xué)、系統(tǒng)的理論數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

榆黃蘑1號、榆黃蘑SW06、榆黃蘑29號，均為陜西省微生物研究所微生物資源中心保藏菌種。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 母種培養(yǎng)基

馬鈴薯250 g（去皮、煮汁）、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g，KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g，酵母膏 2.0 g，VB110.0 mg，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH自然。

1.2.2 栽培培養(yǎng)基

棉籽殼75%、木屑13%、麩皮10%、蔗糖1%、石膏1%，含水量60%～65%。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)及栽培

按上述栽培培養(yǎng)基制備菌袋，選用17 cm×33 cm×0.005 cm聚乙烯塑料袋裝料，每袋裝干料580 g，高壓滅菌后冷卻至室溫；分別接入榆黃蘑1號、榆黃蘑SW06、榆黃蘑29號菌種，恒溫25℃遮光培養(yǎng)；菌絲長滿菌袋后進行常規(guī)出菇管理，出兩潮菇后采收。

1.3.2 粗酶液的制備

在菌絲培養(yǎng)和栽培過程中，分別于菌絲生長至菌袋1/2、菌絲滿袋、現(xiàn)蕾、幼菇期、一潮菇子實體成熟、二潮菇現(xiàn)蕾、二潮菇幼菇期、二潮菇子實體成熟和二潮菇采收1周共9個階段取樣。取培養(yǎng)基上、中、下部位的培養(yǎng)料20 g，混勻后加入100 mL蒸餾水，20℃浸提4 h后過濾，4 000 r·min-1離心5 min，取上清液即為粗酶液[7]。

1.3.3 酶活性的測定

分別按參考文獻 [8-12]測定7種胞外酶活性，濾紙纖維素酶（FP） 60 min內(nèi)催化底物生成1 mg葡萄糖所需的酶量為1個活力單位；羧甲基纖維素酶（CMC）、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶30 min內(nèi)催化底物生成1 mg葡萄糖所需的酶量為1個活力單位；半纖維素酶（HC）30 min內(nèi)催化底物生成1 mg木糖所需的酶量為1個活力單位；漆酶（LAC）、過氧化物酶1 min使OD值改變0.01所需的酶量為1個活力單位。

2 結(jié)果與分析

以編號1～9表示菌絲生長的各個階段（1為菌絲生長至菌袋1/2；2為菌絲滿袋；3為現(xiàn)蕾；4為幼菇期；5為一潮菇子實體成熟；6為二潮菇現(xiàn)蕾；7為二潮菇幼菇期；8為二潮菇子實體成熟；9為二潮菇采收），檢測7種胞外酶各階段活性。

2.1 榆黃蘑不同生長期濾紙纖維素酶活性的變化

3株榆黃蘑不同生長階段濾紙纖維素酶活性變化情況見圖1。

從圖1可以看出，3株榆黃蘑菌種栽培過程中培養(yǎng)基中均能測出濾紙纖維素酶活性，酶活性變化趨勢基本一致；但不同菌株同一生長階段的酶活性有一定差異，榆黃29號產(chǎn)生的濾紙纖維素酶活性最大。在菌絲生長初期濾紙纖維素酶活性均較低，隨著菌絲生長、原基形成和子實體生長，在幼菇期酶活性達到了最大，分別為15.42 U、16.52 U和17.48 U；幼菇期后濾紙纖維素酶活性逐漸降低，在二潮菇現(xiàn)蕾期活性達到最低，之后酶活性又開始上升，在二潮菇幼菇期達到較大，分別為10.19 U、13.09 U和14.87 U；二潮菇幼菇期后又逐漸下降，至二潮菇采后1周時降至最低，分別為3.94 U、5.13 U和6.01 U。

2.2 榆黃蘑不同生長期羧甲基纖維素酶活性的變化

3株榆黃蘑不同生長階段羧甲基纖維素酶活性變化情況見圖2。

從圖2可以看出，3株榆黃蘑菌種在整個生長發(fā)育過程中羧甲基纖維素酶活性變化規(guī)律基本一致，在菌絲生長和原基形成階段酶活性均較低，增長緩慢；原基形成后至幼菇期酶活迅速達到最大值，榆黃蘑1號、榆黃蘑SW06、榆黃蘑29號分別達到22.04 U、25.18 U和27.32 U；隨著子實體成熟和采收，至二潮菇現(xiàn)蕾期羧甲基纖維素酶活性又迅速降至較低，分別為10.14 U、10.88 U和12.41 U；二潮菇現(xiàn)蕾期后酶活又有逐漸升高，在二潮菇幼菇期達到了1個小高峰，隨后酶活性下降，至采收后1周時降至最低，分別為7.99 U、10.16 U和11.45 U。其中以榆黃蘑29號在栽培過程中產(chǎn)生的羧甲基纖維素酶酶活性最大。

2.3 榆黃蘑不同生長期β-葡萄糖苷酶活性的變化

3株榆黃蘑不同生長階段β-葡萄糖苷酶活性變化情況見圖3。

從圖3可以看出，3株榆黃蘑菌種在栽培過程中β-葡萄糖苷酶活性變化規(guī)律基本一致，但不同菌株同一生長階段的酶活性存在一定差異，其中榆黃蘑29號產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活性相對較高。在菌絲生長期間3株菌的酶活性均較低，隨著菌絲生長、原基形成和幼菇生長酶活性緩慢上升，幼菇期后酶活性又緩慢降低，一潮菇子實體成熟期達到1個較低值；之后，緩慢上升至二潮菇現(xiàn)蕾時酶活又達到相對較高，分別為7.13 U、10.42 U和11.97 U；隨后酶活逐漸下降，直至采收結(jié)束酶活性降至最低。β-葡萄糖苷酶在整個栽培過程中沒有出現(xiàn)明顯的活性高峰和階段性變化。

2.4 榆黃蘑不同生長期淀粉酶活性的變化

3株榆黃蘑不同生長階段淀粉酶活性變化情況見圖4。

從圖4可以看出，3株榆黃蘑菌種在栽培過程中淀粉酶活性變化趨勢基本一致，但不同菌株同一生長階段的酶活性存在一定差異，其中榆黃蘑SW06產(chǎn)生的淀粉酶活性相對較高。在菌絲生長初期3株菌的淀粉酶活性均較低，隨著菌絲生長和原基形成對淀粉類物質(zhì)的分解利用，淀粉酶活性逐漸升高，在幼菇期淀粉類酶活力達到最大，分別為32.26 U、36.91 U和35.12 U；之后，酶活性隨著栽培時間的延長逐漸下降，在采收結(jié)束1周時測定的酶活性降至最低，分別為1.68 U、2.93 U和2.02 U。

2.5 榆黃蘑不同生長期半纖維素酶活性的變化

3株榆黃蘑不同生長階段半纖維素酶活性變化情況見圖5。

從圖5可以看出，3株榆黃蘑菌種在栽培過程中半纖維素酶活性變化規(guī)律基本一致，在菌絲生長階段半纖維素酶活性均較低，且增長緩慢；隨著菌絲滿袋和原基形成，培養(yǎng)基中半纖維素酶大量產(chǎn)生，其酶活性快速上升，至一潮菇幼菇期酶活力達到高峰，分別為39.65 U、43.42 U和46.33 U；在幼菇期后酶活性迅速降低，二潮菇原基形成時降至較低，之后又緩慢升高，在二潮菇幼菇期又達到1個小高峰，以后逐漸下降，在采收后1周時酶活性均將至最低，分別為6.34 U、9.17 U和10.54 U。3株菌整個栽培過程中以榆黃蘑29號產(chǎn)生的半纖維素酶活性最高。

2.6 榆黃蘑不同生長期漆酶活性變化

3株榆黃蘑不同生長階段漆酶活性變化情況見圖6。

從圖6可以看出，3株榆黃蘑菌種在整個栽培過程中漆酶活性變化規(guī)律基本一致，隨著栽培時間的延長漆酶活性總體趨勢呈逐漸下降。3株菌在菌絲生長至菌袋1/2時測得的酶活性均較高，分別為30.92 U、34.65 U和33.34 U，隨著菌絲和子實體生長發(fā)育，培養(yǎng)基中的漆酶活力逐漸下降，至二潮菇成熟采收后1周酶活性均降至最低，分別為2.34 U、4.19U和3.54U。其中以榆黃蘑SW06產(chǎn)生的漆酶活性相對最高，其次是榆黃蘑29號。

2.7 榆黃蘑不同生長期過氧化物酶活性的變化

3株榆黃蘑不同生長階過氧化物酶活性變化情況見圖7。

從圖7可以看出，3株榆黃蘑菌種在整個栽培過程中，榆黃蘑SW06和榆黃蘑29號的過氧化物酶活性變化規(guī)律基本一致，在菌絲生長至菌袋1/2至滿袋期間，酶活性緩慢上升至一個小高峰，分別為26.96 U和28.16 U；之后一直呈下降趨勢，在幼菇期酶活降至較低，幼菇期至二潮菇現(xiàn)蕾期雖然有緩慢上升，但升高趨勢不大，二潮菇現(xiàn)蕾期后酶活性迅速下降，至子實體采收后1周后培養(yǎng)基中的酶活性降至最低，分別為3.62 U和4.85 U；榆黃蘑1號的過氧化物酶活性在菌絲生長期、一潮菇現(xiàn)蕾期和幼菇期一直呈緩慢下降，在幼菇期降至較低峰后又緩慢升高，但升高不明顯，之后一直緩慢下降至最低2.01 U。3株榆黃蘑菌種栽培過程中以榆黃蘑29號分泌的過氧化物酶活性相對最高。

3 討論

測定了3株榆黃蘑菌種不同生長發(fā)育階段培養(yǎng)基濾紙纖維素酶、羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、淀粉酶、半纖維素酶、漆酶、過氧化物酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這7種胞外酶活性在整個栽培過程中處于動態(tài)變化，且不同菌株的酶活性變化有一定的差別。

3株榆黃蘑菌種的濾紙纖維素酶、羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和半纖維素酶活性在菌絲生長和子實體形成期都呈上升趨勢，至一潮菇幼菇期酶活性都維持在較高水平，主要是用來分解利用基質(zhì)中的纖維素類、半纖維素類大分子物質(zhì)，滿足子實體生長發(fā)育的營養(yǎng)需求；子實體生長發(fā)育期碳源營養(yǎng)積累充足，酶活性開始下降，至二潮菇生長發(fā)育時積累的營養(yǎng)物質(zhì)被消耗，為繼續(xù)分解利用培養(yǎng)基質(zhì)中纖維素和木質(zhì)素以滿足子實體生長需求，此時誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維素類物質(zhì)水解酶，酶活性又開始呈上升趨勢，隨著子實體成熟采收，酶活性迅速下降。

淀粉酶是分解利用淀粉類物質(zhì)的酶類，為轉(zhuǎn)化吸收淀粉類物質(zhì)，3株榆黃蘑菌種誘導(dǎo)產(chǎn)生了大量的淀粉酶，且栽培過程中淀粉酶活性的變化規(guī)律基本一致。栽培前期酶活持續(xù)上升，在幼菇期時達到最大，此后培養(yǎng)基中的淀粉類物質(zhì)被消耗，直至采收結(jié)束1周后酶活性降至最低。因此，在栽培培養(yǎng)基內(nèi)添加適量淀粉類物質(zhì)有助于提高菌絲活力，可為菌絲生長和子實體發(fā)育提供充足的營養(yǎng)，促進子實體產(chǎn)量的提高。

漆酶和過氧化物酶是參與水解木質(zhì)素的酶類，培養(yǎng)基中的木質(zhì)素被分解作為主要碳源供榆黃蘑生長發(fā)育。本研究表明，3株榆黃蘑栽培過程中漆酶、多酚氧化酶活性變化規(guī)律基本一致，菌絲生長初期木質(zhì)素降解酶活性均較高，此時對基質(zhì)內(nèi)的木質(zhì)素降解利用較快，隨著栽培時間的延長基質(zhì)內(nèi)的木質(zhì)素逐漸減少，之后酶活性一直緩慢下降，直至栽培結(jié)束酶活性達到最低。