2株野生側耳的馴化栽培及營養成分分析*

趙書雪，劉苗苗，吉建成，盧思雨，徐麗麗**

（1.青島農業大學山東省應用真菌重點實驗室，山東 青島 266109；2.青島市農產品質量安全中心，山東 青島 266109）

側耳屬（Pleurotus） 食用菌隸屬于擔子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 傘菌目（Agaricales） 側耳科 （Pleurotaceae）[1]。據報道，我國目前有36種側耳屬真菌，均有較高的蛋白含量、豐富的氨基酸組成[2]，具有較高的營養價值。側耳因其栽培方法簡便，投資小，見效快，效益高等優點而被廣泛栽培[3]。

隨著食用菌馴化栽培技術的不斷發展，人們對野生食用菌資源的開發和利用有了新的認識，側耳屬多糖、蛋白具有增強免疫力，抗癌等功效[4]。通過對野生側耳進行馴化栽培研究，不斷探索野生菌株生長的環境條件，制定出適合野生菌株栽培的方案；不斷優化野生馴化菌株栽培條件，改變其部分特性，逐漸成為適合本地栽培的人工栽培品種；并測定其子實體的營養成分，篩選出最適栽培方法，指導生產實踐。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

側耳屬菌株5271，由云南農科院蘇開美老師于昆明境內采集并贈送；側耳屬菌株1710，采自山東濰坊境內的野生菌株經組織分離純化得到。

1.1.2 供試培養基配方及制備

棉籽殼45%、木屑30%、玉米粉30%、麩皮10%、石膏3%，磷酸二氫鉀0.5%、尿素0.5%，糖1%[5]。栽培種培養基制備料水比為 1∶1～1∶1.8，配制30 kg栽培料，每袋裝約750 g，121℃滅菌2 h。

1.2 主要儀器

日立8900高速氨基酸分析儀：沈陽奇特爾科技有限公司；XSP-9CA顯微鏡：上海光學儀器一廠；MR23i離心機：法國捷安公司；DRP-9082恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；spctro art200分光光度計：美國威泰克公司；EP214C電子天平：奧豪斯國際貿易有限公司（上海）等。

1.3 菌種鑒定方法

1.3.1 菌絲性狀觀察

野生菌株采用組織分離法接種于PDA固體培養基上，將滅過菌的載玻片斜插到離菌塊2 cm處，置26℃恒溫培養箱中暗光連續培養[6]。待菌絲長至載玻片上，取載玻片于顯微鏡下觀察其菌絲結構及有無鎖狀聯合。

1.3.2 菌絲體DNA提取及ITS驗證

采用Ezup柱式真菌DNA抽提試劑盒提取DNA，采用引物 ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’） 進行PCR擴增[7]，得到的PCR產物送北京擎科新業生物技術有限公司測序。

1.4 側耳菌株5271、1710菌絲最適生長條件及栽培條件的優化

1.4.1 菌絲最適生長溫度

取直徑為5 mm的菌株菌餅接種于PDA固體培養基中央，分別于18℃、22℃、26℃、30℃、34℃恒溫培養箱避光倒置培養，每組設置3個重復，連續培養5 d。釆用十字交叉法每天定時測量菌落直徑，計算不同溫度培養條件下菌絲生長速率，菌絲生長速率（V，mm·d-1）計算公式為：

式中：Φ為菌落平均直徑（mm），d為菌絲生長天數（d）。

1.4.2 菌絲最適生長pH

將 pH 設置為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，共 5 個梯度，每組設置3個重復，分別倒置于最適溫度恒溫培養箱避光培養，測定及接種方法同1.4.1。

1.4.3 子實體最適栽培培養基篩選

按照 1.1.2栽培培養基配方，分別培養菌株5271、1710，觀察其子實體栽培性狀（主要是結實性），并進行子實體出菇試驗，探索是否可以應用于實踐，指導實際生產。

1.5 子實體營養成分分析

1.5.1 子實體含水量測定

將新鮮子實體稱重后放入烘箱中，40℃～60℃烘干4 h～5 h，再升溫至60℃～70℃，烘干直至恒重，記錄數據。

1.5.2 子實體中氨基酸含量分析

利用日立8900高速氨基酸分析儀，參考GB 5009.124-2016食品安全國家標準食品中氨基酸的測定測定子實體中氨基酸的含量。

1.5.3 子實體中粗多糖含量測定

按照水提醇沉法[8]提取子實體多糖；按苯酚-硫酸法[9]測定多糖含量，按照NYT 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測定標準繪制葡萄糖標準曲線，后根據標準曲線計算多糖含量。粗多糖提取液中的多糖提取率（T，%）的計算公式為：

式中：C為測定濃度（mg·mL-1）；D為稀釋倍數；V為提取液體積（mL）；ω為稱取子實體粉末質量（g）；0.9 為還原糖換算成多糖的系數[9]。

1.5.4 子實體中粗蛋白含量測定

子實體粗蛋白含量測定采用蛋白定量測試盒[10]測定，計算子實體中粗蛋白含量。

1.5.5 子實體中其他常規營養成分含量測定

參考GB 5009.90-2016食品中鐵的測定測定子實體鐵含量；GB 5009.92-2016食品中鈣的測定測定子實體中鈣的含量；GB 5009.86-2016食品中抗壞血酸的測定測定子實體VC含量；GB 1886.233-2016食品添加劑維生素E測定子實體VE含量。

2 結果與分析

2.1 野生菌株菌絲培養觀察及ITS鑒定

2.1.1 菌絲生長形態

將野生菌株5271、1710菌餅轉接至PDA培養基培養5 d后，菌絲生長情況如圖1、圖2所示。

由圖1、圖2可知，野生菌株5271氣生菌絲生長較發達，呈絨毛狀，菌絲尖端較為粗壯，顏色較白，邊緣生長整齊。野生菌株1710菌落呈絨毛狀，圓形，菌絲潔白，菌落正反顏色無差異，菌落邊緣較整齊，濃密。

2.1.2 野生菌株ITS鑒定

2株野生菌株ITS序列擴增電泳圖見圖3。

由圖3可知，野生菌株5271、1710通過ITS1和ITS4引物擴增后的堿基數約為700 bp。通過測序比對發現，菌株5271與肺形側耳Pleurotus pulmonarius有99%的相似性，菌株1710與紫孢側耳Pleurotus sapidus有99%的相似性。

2.2 培養條件篩選結果

2.2.1 溫度對2株菌絲生長的影響

菌株在不同溫度梯度培養5 d，各菌株菌絲生長情況見圖4，菌絲生長速率見圖5。

由圖5可知，菌株5271在26℃時，菌絲生長速率最快，菌絲稠密、潔白，菌絲邊緣生長整齊，在其他溫度時菌絲生長速率較慢。菌株1710在30℃時，菌絲生長速率最快，菌絲潔白、稠密，菌絲邊緣生長整齊，在34℃時，2菌株菌絲仍可生長，菌株1710菌絲生長速率比5271快，耐受溫度高。綜上所述，在試驗溫度梯度中，最適5271菌絲生長溫度為26℃，1710菌絲生長最適溫度為30℃。

2.2.2 pH 對 2 株菌絲生長的影響

2株菌株在不同培養基pH且置于最適生長溫度下培養5 d，菌絲生長情況見圖6，菌絲平均生長速率統計見圖7。

由圖6、圖7可知，2株菌株在pH為7條件下長勢均較好，在pH5～9均能生長；菌株5271菌絲邊緣整齊、菌絲較白；菌株1710菌絲潔白、邊緣整齊、稠密。可見pH對菌絲生長速率影響較小，菌株1710菌絲長勢優于5271生長情況。綜上，2株菌株生長的最適pH為7。

2.3 2株野生菌株出菇試驗結果

2.3.1 野生菌株栽培培養基篩選結果

對結實性的考察主要是考察原基形成所需時間。菌株5271原基形成時間20 d，1710原基形成時間17 d，2株菌株從原基形成到采收第一茬需要約5 d。子實體出菇條件為溫度15℃～17℃、濕度85%，光照強度為600 lx[11]，2株菌菌絲在菌包中生長速度較快、形成原基時間短、出菇期間轉潮快、出菇持續時間長，此時菌株5271、1710生物學效率分別達 100.03%、105.97%。

2.3.2 菌株子實體特征

2株野生菌株人工培養出菇結果見8。

如圖8A所示，菌株5271菌蓋形狀呈扁半球形至平展，倒卵形至腎形或近扇形，大小5 cm～13 cm，顏色為白色、灰白色至灰黃色，表面光滑，菌肉白色，靠近基部稍厚；菌褶白色，延生，稍密，不等長；菌柄很短或沒有，白色有絨毛，后期近光滑，內部實心至松軟。從圖8B看出菌株1710子實體菌蓋呈黑褐色，與菌株5271顏色完全不同，呈半球形，靠近基部稍厚，菌褶白色，延生；菌柄較長。

2.3.3 菌株孢子印及孢子形態觀察

菌株5271野生菌株孢子印及孢子形狀見圖9，菌株1710野生菌株孢子印及孢子形狀見圖10。

由圖9、圖10所示，菌株5271孢子印呈扁半球形，白色；孢子淺綠色，呈近梭形。菌株1710孢子印呈近圓形，顏色為白色；孢子淡黃色，呈近梭形。

2.4 子實體營養成分分析結果

2株子實體中營養成分含量見表1。

表1 2株子實體中營養成分含量Tab.1 Content of nutrients in two fruiting bodies

由表1可知，2株菌株營養成分含量存在差異，其中，菌株5271、1710子實體中粗多糖含量分別含有 12.47 g·100-1g-1、19.42 g·100-1g-1，均比文獻[12-13]報道高；菌株5271、1710子實體中粗蛋白質含量分別為 13.14 g·100-1g-1、15.40 g·100-1g-1。測定的微量元素Fe、Ca含量均較高，菌株1710子實體中 Fe含量高達 173.78 mg·100-1g-1。菌株 1710子實體中VE含量高于5271子實體中的含量，兩者相差2.28倍。而菌株5271子實體中VC含量是1710的4.55倍。根據綜合分析，1710菌株有更高的營養價值。

2.5 菌株氨基酸含量分析結果

采用日立L8900型氨基酸自動分析儀測得了2株側耳屬菌株中17種氨基含量，包括賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸8種必需氨基酸（EAA），天門冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、酪氨酸、精氨酸、脯氨酸9種非必需氨基酸（NEAA）[14]，由于采用酸水解法使得色氨酸結構不穩定，試驗未測。與已報道的糙皮側耳（Pleurotus ostreatus） 子實體氨基酸含量為對比[15]，2株野生側耳與糙皮側耳中氨基酸含量見表2。

由表2可知，2株菌株中17種氨基酸含量均不同，其中，2株菌株中酪氨酸、苯丙氨酸含量相差較大，約1.3倍左右。與糙皮側耳子實體蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸等含量相差不大（胱氨酸未檢測），纈氨酸、酪氨酸、組氨酸、蛋氨酸含量相差較大。菌株5271子實體中氨基酸總量、EAA、NEAA氨基酸含量均高于1710子實體，與糙皮側耳相差不大。

表2 2株野生側耳與糙皮側耳中氨基酸含量比較Tab.2 Comparison of amino acid contents between two wild Pleurotus spp.pellucidum

3 討論

對野生菌種質資源的采集和鑒定是食用菌產業發展的一項基礎性研究工作[15]，通過馴化篩選可得到更多的工廠化栽培菌種。目前對野外采集真菌主要通過形態、ITS等進行鑒定。通過對采集的野生菌種鑒定可知菌株5271為肺形側耳，1710菌株為側耳屬紫孢側耳。研究了菌株5271、1710菌絲生長的最適條件；通過栽培條件篩選試驗發現該2株菌株都具有優良的栽培性狀。2株菌株子實體中粗蛋白、粗多糖、微量元素、VC、VE及氨基酸含量進行測定，綜合分析，發現1710子實體營養價值更高。試驗對野生側耳屬真菌的馴化栽培研究可為今后側耳屬真菌野生資源開發利用，新種質資源的獲取及遺傳育種等提供理論依據。