樺褐孔菌多糖的提取工藝、結構及功能活性研究進展*

黃明飛，仝 濤，2**，黃昆侖，2

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心（中國農業大學），北京 100083）

樺褐孔菌[Inonotus obliquus（Fr.）Pilat]是一種主要生長于白樺樹、榆樹等樹皮上的木腐真菌。主要分布于北半球北緯40°～50°地區，如我國黑龍江省小興安嶺、吉林省長白山和內蒙古等區域及日本北海道、俄羅斯西伯利亞和遠東地區、芬蘭及波蘭等區域[1-2]。休眠體外形為不定性塊狀，子實體具不孕性，菌絲可耐-40℃的極度低溫，隨著生長時間的增加其菌落的顏色會逐漸變深，依次為白色、淡黃色、黃色和黃褐色，并在風和陽光等因素的作用下，形態由早期柔嫩的絨毛狀逐漸變為為硬實的塊狀[3]。

約在500年前，俄羅斯、波蘭及芬蘭等地習慣將樺褐孔菌作為天然藥物來預防和治療癌癥、心臟病、肝病及糖尿病等各種難辨或難治的病癥[4]。樺褐孔菌的化學成分主要有樺褐孔菌多糖、樺褐孔菌醇、樺褐孔菌素、羊毛甾醇型三萜類、葉酸衍生物、芳香物質、木質素衍生物、單寧及栓菌酸等，其中起主要藥理作用的為樺褐孔菌多糖、樺褐孔菌醇、樺褐孔菌素、羊毛甾醇型三萜類和木質素[5]。樺褐孔菌多糖是樺褐孔菌中的重要活性成分，具有抗糖尿病、調節腸道菌群、治療炎癥、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤等多種功能活性，因而在近些年的研究中備受關注[6]。

目前我國的樺褐孔菌資源還未受到足夠的重視和有效的利用，隨著樺褐孔菌多糖功能活性和結構的深入研究，樺褐孔菌多糖的工業化、產品化將成為必然的趨勢。因此，通過對國內外文獻中關于樺褐孔菌多糖提取工藝、結構及功能活性的研究結果作一概述，希望能為樺褐孔菌多糖的進一步研究、工業化生產以及相關產品的研發提供一定的理論依據。

1 樺褐孔菌多糖的提取工藝研究

樺褐孔菌多糖提取工藝關系到所獲得的樺褐孔菌多糖的質量、純度及活性。其提取工藝主要涉及提取、純化、分離、干燥等步驟，因此，對樺褐孔菌多糖提取工藝的研究具有重要意義，能夠為樺褐孔菌多糖的工業化生產提供一定的參考。

1.1 樺褐孔菌多糖的提取方法

真菌多糖以天然產物的形式存在，可用于真菌多糖提取的方法繁多，如水提取法、酸提取法、堿提取法、酶解法、微波提取法、超聲提取法、超臨界萃取法、閃式提取法等，或多種方法聯合應用[7]。同一提取方法受樣品粒徑、提取溫度、提取時間、料液比、提取次數、pH等多種因素的影響，因此多糖活性、多糖提取率、功耗也會有所不同。李依韋等[8]在熱水浸提樺褐孔菌多糖中結合單因素試驗和正交試驗研究了料液比、提取溫度、提取時間、pH4個因素對樺褐孔菌多糖提取的影響，結果表明4個因素均對樺褐孔菌多糖的提取有顯著影響，各因素影響作用的大小排序結果為提取溫度>pH>料液比>提取時間。

水提取法和堿提取法是樺褐孔菌多糖2種常用提取方法。張麗霞等[9]通過單因素試驗和正交試驗優化了樺褐孔菌多糖堿提取法最佳工藝參數為氫氧化鈉溶液濃度 0.5 mol·L-1，料液比為 1 ∶30(g∶mL)，提取溫度為80℃，在最佳的工藝參數下，樺褐孔菌堿溶多糖的提取率可達3.83%。但由于堿提取法的提取條件較為嚴格、操作風險和實施難度較大，因此，水提取法使用頻率相較堿提取法要更高。

為了提高水提法獲得產物的含量，人們經常會采用超聲、微波、酶等手段輔助提取。Hwang等[10]比較了傳統的熱水浸提法和非傳統提取方法（超聲提取、酶提取、高溫高壓提取）從樺褐孔菌中提取功能活性物質的差異，研究發現通過高溫高壓獲得的樺褐孔菌多糖含量最高（5.88%），酶提取的樺褐孔菌多糖含量（5.86%）顯著高于熱水浸提的樺褐孔菌多糖含量（3.81%），超聲提取的樺褐孔菌多糖含量最低（3.02%）。但張麗霞等[11]通過對比試驗發現超聲提取的樺褐孔菌多糖含量（5.03%）高于傳統的熱水浸提法（3.17%），其超聲提取的條件為超聲波振蕩預處理20 min后60℃恒溫水浴抽提2次，料液比為1∶50(g∶mL)，而Hwang等[10]的超聲提取的條件為50℃下超聲提取2 h，料液比為1∶40(g∶mL)，結果有差異的原因可能是超聲提取時間過長導致樺褐孔菌多糖發生降解，從而使超聲提取的樺褐孔菌多糖含量低于傳統的熱水浸提法。

1.2 樺褐孔菌多糖的分離方法

多糖的分離涉及多糖提取液雜質去除，經提取方法獲得的多糖提取液往往含有較多的雜質，如蛋白質、色素、無機鹽、單糖、寡糖等物質，這些雜質的存在會對多糖的結構、功能活性等方面的研究造成影響。因此，對多糖提取液進行純化處理是提取工藝中十分關鍵的步驟。

1.2.1 脫除蛋白質

蛋白質和多糖具有許多類似的特征，如親水性、結構復雜、組成多樣等，并且二者又常以糖蛋白的形式存在，使得從多糖提取液中脫除蛋白質較為困難，在脫除蛋白質的同時會造成一定程度的多糖損失。沙維積法（Sevag法）、三氯乙酸法、鹽酸法、酒精變性法、蛋白酶法以及多種方法聯用是目前常用的脫蛋白方法，各種方法的具體原理及特點見表1[12]。

王艷波[13]通過試驗比較蛋白酶法、三氯乙酸法、沙維積法（Sevag法）、酶法輔助三氯乙酸法4種脫蛋白方法對樺褐孔菌粗多糖脫蛋白處理產生的影響，結果表明酶法輔助三氯醋酸法是最佳脫蛋白方法，具有82.32%的蛋白脫除率和76.13%的多糖保留率。

1.2.2 脫除色素

對多糖溶液進行脫色的方法有許多種，如活性炭脫色、過氧化氫脫色、樹脂脫色、氧化鋁柱層析、聚酰胺脫色、靜態混合器脫色是目前較為常用的脫色方法，但具體試驗中脫色方法的選擇應考慮色素類型、多糖來源、試驗室條件等因素[14]。但應該盡量避免活性炭脫色方法的使用，由于色素被活性炭吸附時多糖也會被吸附，從而造成多糖含量的減少[15]。

表1 常用的脫蛋白方法的原理及其特點Tab.1 Principles and characteristics of common deproteinization methods

玄光善等[16]比較了活性炭脫色、過氧化氫脫色、殼聚糖脫色、聚酰胺脫色4種脫色方法對樺褐孔菌多糖脫色的影響，結果表明4種脫色方法均有效果，其中聚酰胺脫色相對較好，具有89.3%的脫色率和91.7%的多糖保留率。

1.3 樺褐孔菌多糖的純化方法

多糖的純化涉及到分離混合多糖，經過提取、純化后獲得的多糖提取物一般為具有多種多糖組分的混合多糖，若想獲得均一多糖，還需對混合多糖進行分離。目前有多種分離方法可用于混合多糖分離，如分級沉淀法（季銨鹽沉淀法、鹽析法、醇沉淀法、金屬絡合物法）、柱層析分離法（纖維素陰離子交換柱層析、纖維素柱層析、凝膠柱層析和親和柱層析）、超濾分離法等[20]。其中醇沉淀法是多組分多糖純化最常用的方法，Du等[21]將體積分數為95%的乙醇加入濃縮多糖上清液中，獲得了3種樺褐孔菌多糖 （Inonotus obliquus polysaccharides，IOP） 組分，達到體積分數為40%的酒精得到的沉淀命名為IOP40；達到體積分數為60%的酒精得到的沉淀命名為IOP60；達到體積分數為80%的酒精得到的沉淀命名為IOP80。

1.4 樺褐孔菌多糖的干燥方法

不同的多糖干燥方法對真菌多糖的功能活性和理化特性有顯著的影響。目前常用的多糖干燥方法有熱風干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、紅外線干燥、微波干燥等[24]。

Ma等[25]研究比較了冷凍干燥、熱風干燥和真空干燥3種干燥方法處理后樺褐孔菌多糖的理化性質和抗氧化性能差異，發現3種干燥方法處理對其多糖的理化性質和抗氧化性能有不同影響。與熱風干燥和真空干燥相比，冷凍干燥使樺褐孔菌多糖具有更低的分子量分布、具有三螺旋結構的超支化構象，更高的清除DPPH自由基、降低鐵還原力和抑制脂質氧化活性的抗氧化能力。因此，相較于其他干燥方法，冷凍干燥對樺褐孔菌多糖活性的影響較小，能夠較大程度保留樺褐孔菌多糖活性，然而在實際的生產操作中也存在著能耗較大的缺點。相信隨著冷凍干燥技術的進步，其將在真菌多糖的干燥中會有更多的應用。

2 樺褐孔菌多糖的結構研究

樺褐孔菌多糖是至少由10個小分子單糖構成的高分子質量的糖類化合物，其結構復雜，且結構特征與功能活性關系十分緊密[26]。目前對樺褐孔菌多糖結構的研究主要集中于對多糖組分、相對分子質量、不同糖基的組成比例及其連接情況等一級結構上[28]。

2.1 多糖結構的研究方法

多糖結構的研究主要分為結構特征和構象特征兩方面。目前有多種研究多糖結構和構象特征方法，如紅外光譜、液相核磁共振（一維和二維）、固體核磁共振、拉曼光譜、氣相色譜、氣相色譜-質譜聯用、高效液相色譜等方法對結構特征進行分析；采用靜態和動態光散射、基于稀釋聚合物溶液理論的粘度分析、圓二色分析、原子力顯微鏡（包括單分子原子力顯微鏡和基于原子力顯微鏡的單分子力譜）、熒光相關光譜、核磁共振光譜等方法對構象特征進行分析[29]。

2.2 樺褐孔菌多糖結構的研究現狀

目前對于樺褐孔菌多糖結構的研究剛剛起步，研究程度較淺。李娟[30]采用紅外光譜法和核磁共振法對樺褐孔菌多糖的結構進行了初步分析，結果表明樺褐孔菌多糖主要由吡喃糖組成，樺褐孔菌發酵產物中的胞外多糖主要構型為α構型，而樺褐孔菌發酵產物中的胞內多糖和樺褐孔菌子實體的多糖主要構型為β構型，發酵胞外多糖的數均分子量為29 kDa～55 kDa，胞內多糖數均分子量為 89 kDa～96 kDa，子實體多糖組分的數均分子量是21 kDa。許泓瑜等[31]通過紅外光譜和氣相色譜分析，發現樺褐孔菌多糖的糖苷鍵主要是α型，主要單糖組成及質量分數分別為阿拉伯糖（0.53%）、甘露糖（0.48%）、葡萄糖 （10.75%）、半乳糖 （2.44%）。玄光善等[32]通過氣相色譜分析出樺褐孔菌多糖的單糖組成為鼠李糖 （3.84%）、阿拉伯糖 （3.69%）、木糖 （3.32%）、甘露糖 （18.52%）、葡萄糖 （27.30%）、半乳糖（28.17%）。目前對部分樺褐孔菌多糖組分的分析結果見表2[33-36]。

表2 樺褐孔菌多糖組分的分析Tab.2 The analysis of Inonotus obliquus polysaccharides components

表2所示，陳義勇[33]用DEAE-SepharosCL-6B柱分離純化樺褐孔菌多糖后得到4個組分，IOP1為中性多糖，IOP2、IOP3、IOP4為酸性多糖，總分子質量約為157 kDa。張麗霞[34]用DEAE-纖維素和分子篩層析相結合的方法，對熱水煮提和乙醇沉淀獲得的樺褐孔菌多糖進行分級后得到5個組分：2種中性多糖IOPN-I和IOPN-II，數均分子量分別為3.3 kDa、2.6 kDa；3 種酸性多糖 IOPS-I-A、IOPSI-B 和 IOPS-II-A，數均分子量分別為 3.5 kDa、2.6 kDa、3.1 kDa；對稀堿溶液煮提和乙醇沉淀獲得的堿溶樺褐孔菌多糖（alkali soluble Inonotus obliquus polysaccharides，AIOP） 進行分級后得到2個組分：2種堿溶性多糖AIOP-I和AIOP-II，數均分子量分別為 3.2 kDa、3.4 kDa。榮芳悅[35]采用 DEAE-52 纖維素柱層析法分離樺褐孔菌多糖，獲得了IOP1、IOP2、IOP3、IOP4和 IOP5共5種均一多糖。Ping等[36]用DEAE-52纖維素柱層析法以及Sephadex G-100柱層析法從水提粗多糖中分離純化了2種多糖（heteropoly Inonotus obliquus polysaccharides,HIOP），HIOP1-S主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和海藻糖組成，平均分子量13.6 kDa；HIOP2-S主要由葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成，平均分子量15.2 kDa。

由上述結果可知，目前對樺褐孔菌多糖的糖苷鍵、單糖組成、組分分析、分子質量等結構的研究結果存在差異，可能是由于影響結構的因素多種多樣，如樣品產地、樣品生長狀態、提取方法及純化方法等，造成所得的純多糖有不同，從而導致研究結果的差異。

3 樺褐孔菌多糖的功能活性研究

研究結果表明植物多糖具有良好的功能活性，而且對生物體幾乎沒有副作用，因此吸引了許多科學家從事多糖功能活性的相關研究[37]。通過綜合國內外文獻，對目前報道的樺褐孔菌多糖的功能活性進行論述。

3.1 抗Ⅱ型糖尿病

Ⅱ型糖尿病是一種常見的因代謝問題而引起的疾病，其特征是機體對胰島素反應不敏感而導致的慢性高血糖。據國際糖尿病聯合會2019年的報道，我國是糖尿病患者最多的國家，共計1.16億[38]。Wang等[39]以鏈脲霉素誘導的Ⅱ型糖尿病小鼠為模型研究時發現，口服樺褐孔菌多糖（900 mg·kg-1小鼠體重）可以顯著恢復小鼠的體脂質量，降低空腹血糖水平，提高葡萄糖耐受能力，增加肝糖原水平，改善胰島素抵抗（P<0.01）。樺褐孔菌多糖可能的抗Ⅱ型糖尿病的機制見圖1。

由圖 1所示，磷脂酰肌醇-3激酶 （phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K） 是胰島素受體底物的靶蛋白，在胰島素信號轉導中不可或缺。激活胰島素受體底物可以使PI3K的P85調節亞基磷酸化，進而磷酸化下游蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）。磷酸化后的PKB抑制關鍵酶（磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶）的表達，進而抑制肝臟糖異生，還可促進葡糖糖轉運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4） 向細胞表面轉運，刺激肌肉和脂肪組織攝取葡萄糖。

Wang等[40]同樣以鏈脲霉素誘導的Ⅱ型糖尿病小鼠為模型，探究了樺褐孔菌多糖對糖尿病的影響。結果表明腹腔注射120 mg·kg-1小鼠體重的甲硫胺素和50 mg·kg-1小鼠體重的IO4（50%～80%乙醇沉淀的樺褐孔菌多糖）或IO5（總80%乙醇沉淀的樺褐孔菌多糖），可逆轉糖尿病小鼠體重和空腹血糖水平的異常變化，能顯著提高血清中胰島素和丙酮酸激酶水平，促進肝糖原和肌糖原的合成。以上試驗結果為樺褐孔菌多糖具有潛在降血糖功能提供了依據。

3.2 調節腸道菌群

多糖作為益生元能夠有效抑制代謝性疾病和調節腸道微生物菌群[41]。Hu等[41]研究發現口服100 mg·kg-1～300 mg·kg-1小鼠體重的樺褐孔菌多糖均會影響小鼠的腸道微生物組成和多樣性。樺褐孔菌多糖處理組的小鼠腸道菌群的多樣性降低，表現為香農（Shannon）多樣性指數和Chao1估計量比其他的更低。樺褐孔菌多糖增加了擬桿菌門菌種比例，降低了厚壁菌門菌種比例。擬桿菌門與谷胱甘肽過氧化物酶和總抗氧化能力呈正相關，厚壁菌門與腫瘤壞死因子-α、轉化生長因子-β和脂肪酶相關。谷胱甘肽過氧化物酶是一種重要的超氧化物降解酶，被認為是生物體抗氧化能力的指標，而谷胱甘肽過氧化物酶水平的降低在癌癥、硬化和慢性胰腺炎患者中普遍存在[42]。

3.3 治療腸道炎癥

炎癥性腸病是一種與具有白細胞分化抗原4的T細胞（CD4+T）亞群失衡相關的腸道慢性炎癥性疾病[43]。CD4+T細胞的亞種群根據細胞分化和細胞功能的不同可以由輔助性T細胞（Th1、Th2、Th17）和調節性T細胞（Treg）這4種主要的亞種群組成。這些細胞之間的免疫失衡可能是炎癥性腸病發病過程中最直接、最重要的因素。Chen等[43]研究發現，作為樺褐孔菌主要活性成分的樺褐孔菌多糖可減輕右旋糖酐硫酸鈉誘導的小鼠慢性腸道炎癥。口服樺褐孔菌多糖 （100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、300 mg·kg-1小鼠體重）可顯著降低結腸炎小鼠的疾病活動指數，緩解結腸炎小鼠的病理變化，減少結腸組織中緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的丟失，并調節結腸組織、腸系膜淋巴結和脾臟中Th1/Th2和Th17/Treg的失衡。

3.4 抗氧化

機體在生命活動中會不斷產生各種活性氧自由基，其具有較高的化學反應性，過多的活性氧自由基易引起部分酶的脂質過氧化和氧化，以及大量蛋白質的氧化和降解，從而引起一系列的疾病，因此藥物抗氧化功能的研究備受關注[44-45]。Chen等[46]研究發現樺褐孔菌多糖具有明顯的羥自由基、DPPH自由基的消除作用和肝臟脂質過氧化的抑制作用，并呈現出劑量效應。樺褐孔菌多糖的抗氧化能力受多種因素影響，如產地、提取方法等。王晶波等[6]比較了來源于5個地區（俄羅斯、吉林樺甸、黑龍江大興安嶺、吉林長白山、云南香格里拉）的樺褐孔菌的多糖提取率和抗氧化活性的差異，發現多糖的抗氧化能力和多糖提取率緊密相關，其中來自云南和俄羅斯的樺褐孔菌多糖抗氧化能力最強。Zhang等[47]探究了不同的提取方法對樺褐孔菌多糖抗氧化活性的影響，結果表明水溶性多糖的抗氧化活性高于堿溶性多糖。此外，有研究表明，通過化學修飾[48]、物理改性[49]、球磨預處理[50]等方法可以顯著提高樺褐孔菌多糖的抗氧化能力。

3.5 抗疲勞

疲勞是一種由于壓力和過度的體力腦力勞動而導致身體或精神極度疲勞的感覺[51]。Zhang等[51]研究發現通過DEAE纖維素-52色譜法獲得的樺褐孔菌多糖組分（PIO-1）不僅具有延緩身體疲勞的巨大潛力，而且具有改善精神疲勞的潛力。強迫游泳試驗結果表明，口服50 mg·kg-1的PIO-1能夠增加小鼠的攀爬持續時間和游泳時間以及減少小鼠的不動時間。樺褐孔菌多糖可能的抗疲勞機制見圖2。

由圖2可知，PIO-1降低了小鼠血乳酸、尿素氮和乳酸脫氫酶的水平，降低了小鼠大腦中5-羥色胺的濃度。血乳酸是在厭氧條件下的糖酵解產物，細胞內乳酸的積累會導致疲勞。血清中尿素氮水平的升高通常代表肌肉收縮力的損傷，過量的尿素氮反映了蛋白質的分解，從而減弱肌肉收縮，引起疲勞。5-羥色胺的強烈釋放會抑制節律活動和運動神經元激活，導致中樞疲勞。這些與疲勞相關的代謝參數的變化說明了PIO-1具有延緩身體疲勞和改善精神疲勞的潛力。然而，仍需對PIO-1進行詳細的結構描述，以揭示其結構與抗疲勞活性之間的關系。

3.6 抗腫瘤

癌癥是經濟發達或欠發達國家的主要死亡原因之一。據估計，到2020年，中國將有約451萬例癌癥病例和304萬例癌癥死亡病例[52]。Jiang等[53]研究發現樺褐孔菌多糖能夠激活肺癌細胞中磷酸腺苷依賴性蛋白激酶，從而在體內外降低癌細胞的線粒體膜電位，誘導癌細胞凋亡。磷酸腺苷依賴性蛋白激酶在維持能量穩態方面起著關鍵作用。陳義勇等[54]研究發現樺褐孔菌多糖在體內外均對腫瘤細胞的增殖具有很強的抑制作用，能夠在體外直接殺死Jurkat腫瘤細胞（人淋巴瘤細胞） 和Daudi腫瘤細胞（人淋巴瘤細胞）并表現出了劑量效應，最高的抑制率分別達62.29%和66.42%，同時能在體內殺死腫瘤細胞，大劑量組（100 mg·kg-1的樺褐孔菌多糖） 和小劑量組（50 mg·kg-1的樺褐孔菌多糖） 對Jurkat腫瘤細胞的抑制率分別為43.52%和57.48%。

4 展望

綜上所述，目前人們對于樺褐孔菌多糖提取工藝方面的研究已經趨于完善，能在試驗室中較好的獲得樺褐孔菌多糖。但樺褐孔菌多糖結構方面的研究剛起步，主要集中在一級結構的研究上，并且研究結果有所差異，重現性差；而對其功能活性，則有較廣泛的研究和認識。

今后樺褐孔菌多糖可能的發展趨勢及研究方向如下。

1）深入樺褐孔菌多糖結構的研究。明確多糖的組分、相對分子質量、各種糖基的組成比例及其連接情況，對多糖的高級結構進行探究。

2）加強對樺褐孔菌多糖結構特征與功能活性關系的研究。多糖的結構特征與功能活性的關系非常緊密，對多糖結構特征與功能活性間關系的揭示，有助于加深人們對多糖的理解。

3） 揭示樺褐孔菌多糖在分子水平上的作用機制。從分子水平上揭示樺褐孔菌多糖在體內發揮作用的機制，有利于發現樺褐孔菌多糖眾多功能活性的共同點，更好地解釋樺褐孔菌多糖的功能活性。

4）確定適合工業化生產樺褐孔菌多糖的工藝流程以及相應的設備選型，開發相關的產品。有利于實現樺褐孔菌多糖的工業化生產，促進相關研究轉化為生產力，進而改善人們的生活品質。