樹上干杏指紋圖譜構建與親緣關系研究初探

叢桂芝 王瑾 陳淑英 石游 陶俊 阿布地薩拉木·艾尼外爾 許正

摘要：為進一步探究樹上干杏親緣關系，本研究利用SSR分子標記引物技術，通過PCR擴增及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對樹上干杏等9個杏品種（類型）的18對SSR多態性引物進行鑒定，獲得DNA指紋圖譜，從DNA水平鑒定伊犁樹上干杏品種與其他杏品種（類型）之間的親緣關系遠近。對各杏品種（類型）間親緣關系進行聚類分析，結果表明：杏1（樹上干杏1號）和杏2（樹上干杏2號）2個品種差異較大，杏4（樹上干杏4號）與杏1（樹上干杏1號）為同一類。與杏1（樹上干杏1號）親緣關系由近及遠依次為鞏留野杏、珍珠油杏、第四師61團古杏，其遺傳相似性系數范圍為0.673～0.808。杏3（樹上干杏3號）與杏2（樹上干杏2號）為同一類，與李光杏親緣關系較近，其遺傳相似性系數范圍為0.654～0.846?；舫且靶优c樹上干杏親緣關系較遠。

關鍵詞：樹上干杏；SSR分子標記；DNA指紋圖譜；聚類分析；親緣關系

中圖分類號：S662.2文獻標志碼：A論文編號：cjas20191100269

The Fingerprint Structure and Genetic Relationship of Shushanggan Apricot： A Preliminary Study

Cong Guizhi， Wang Jin， Chen Shuying， Shi You， Tao Jun， Abudusalamu Ainiwaier， Xu Zheng

（Ili Academy of Forestry Sciences， Ili 835000， Xinjiang， China）

Abstract： To explore the genetic relationship of Shushanggan apricot， SSR molecular marker technology was used by PCR amplification and a modified polyacrylamide gel electrophoresis， 18 pairs of SSR polymorphism primers were identified in nine varieties （types） of Shushanggan apricot and other apricots， to get the DNA fingerprint. The genetic relationship between Shushanggan apricot and other apricot varieties （types） were identified from different DNA levels. The genetic relationship of apricot varieties （types） were analyzed by clustering. The results showed that Shushanggan apricot had two different varieties， namely Shushanggan apricot No.1 and Shushanggan apricot No.2. Shushanggan apricot No.4 and Shushanggan apricot No.1 were the same type. The close genetic relationship to Shushanggan apricot No.1 was Gongliu wild apricot>pearl oil apricot>Disishi 61 Tuan ancient apricot， the genetic similarity coefficient ranged from 0.673 to 0.808. Shushanggan apricot No.3 and Shushanggan apricot No.2 were the same type， and they were closely related to Liguang apricot， the genetic similarity coefficient ranged from 0.654 to 0.846. Huocheng wild apricot was far related to Shushanggan apricot.

Keywords： Shushanggan Apricot； SSR Molecular Marker； DNA Fingerprint； Cluster Analysis； Genetic Relationship

0引言

遺傳多樣性是物種適應自然和進化的基本特征，它源于不同的核酸序列和基因突變。天然樹木軀體的遺傳多樣性程度受遺傳漂變、遷移、突變和選擇等綜合因素的影響，其基因頻率會在一定的水平上波動，反映在核酸水平上會呈現出特定DNA片段的多態性[1-2]。因此，利用分子標記技術對遺傳多樣性進行快速檢測，可以免受環境、組織特異性和發育階段的影響[3]。

在種質資源研究領域中分子標記主要應用在2個方面。首先是指紋圖譜的構建，用于種質資源的鑒定；其次是對種質資源間的遺傳多樣性進行研究，區分品質間的親緣關系[4-5]。由于樣本基因組微衛星座位的復等位性，使該技術易于鑒別同一物種的不同基因型，從而反映出樣本間的差異性[6]。SSR技術在果樹種質資源的研究領域中應用很廣泛。何天明等[7]從核果類果樹種質資源的遺傳分析角度出發，主要從品種鑒定和親緣關系分析、一些重要農藝性狀的標記以及遺傳連鎖圖譜的構建等方面對SSR分子標記技術在這一領域的研究進展進行了綜述。俞明亮等[8]應用SSR標記技術分析桃種間的演化模式，同時采用集群分離分析法對白肉/黃肉、毛桃/油桃、花粉可育/花粉敗育3個性狀進行了標記研究，開創了分子標記輔助育種技術在桃種質遺傳育種研究領域應用的先河。何天明等[9]用SSR標記技術鑒定了中國西部伊犁山谷野山杏的群體遺傳結構。Graharm等[10]通過10個隨機引物擴增的指紋圖譜區分了10個樹梅品種。Thomas等[11]利用5對引物對葡萄進行PCR擴增，成功區分了33個不同的葡萄品種。Galli等[12]利用SSR分子標記區分了蘋果的66個栽培品種。

對于相同物種的不同品種來說，含有大量的多態性標記，任何品種都有不同于另外品種的特有標記，也就是一些特異性DNA片段的組合，稱為該物種的“指紋”，DNA指紋圖譜技術是對遺傳物質的多態性直接分析與檢測，以此診斷物種基因的分布和表現規律，已經在果樹種質資源研究中廣泛地應用[13-15]。由于是以DNA的形式直接表現，其反映出來的差異也就是基因型差異，所以更為可觀精準，是目前應用最為廣泛的指紋圖譜技術[16-18]。

樹上干杏屬新疆杏的地方品種，為中亞品種群[19]，為小果杏類品種，是新疆伊犁河谷特有鮮食、制干兼仁用的鄉土杏良種，果實個小質輕，單果質量10～30 g，鮮杏成熟后，色澤黃中帶紅，非常鮮艷，果肉香甜美味，干杏果肉純美甘甜，杏核極薄，輕嗑即食，果仁香甜，營養物質含量豐富，口感好，風味獨特，品質極佳，可在樹枝上自身脫水風干不落，俗稱“吊死干”，當地哈語為“梅孜吳爾克”，維語為“古麗卡克”，商品名樹上干杏[20]。

伊犁地區天山野杏林是國內野杏的重要集中地，天山野杏是栽培杏的直接祖先，主要分布在海拔950～ 1400 m的低山帶，是落葉闊葉林的重要組成樹種，有些新疆野杏及野生類型杏因品質優良，完全可與栽培杏的優良品種相媲美[21]。

為進一步探究樹上干杏親緣關系，本研究采用SSR（simple sequence repeat）分子標記技術[22]，利用不同地域9個杏品種（類型）的18對SSR引物進行遺傳多樣性研究，獲得DNA指紋圖譜，旨在為確定樹上干杏品種親緣關系提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

本研究選擇新疆伊犁河谷樹上干杏3個選育品種（樹上干杏1號、樹上干杏2號、樹上干杏3號）及優良類型樹上干杏4號，與分布在河谷不同地域內、同樹上干杏性狀相近的2個栽培品種（李光杏、珍珠油杏）、1棵古杏、2個野杏類型，合計9個杏品種（類型）為試驗材料（表1）。

1.2方法

1.2.1 DNA提取采用改良CTAB法提取杏基因組DNA[23]，并進行DNA樣品濃度和純度的測定。具體操作步驟如下：（1）取幼嫩真葉材料一小片，用蒸餾水沖洗干凈，置1.5 mL的離心管中，加液氮，快速冷卻。（2）將材料快速研磨成粉末，然后加入65℃預熱的CTAB提取緩沖液700μL。（3）放入65℃水浴30～40 min，每10 min輕輕地振蕩一次。（4）加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1） 700μL，混勻5 min，12000 r/min離心5 min。（5）取上清液轉入另一1.5 mL新離心管中，加入經冰箱冷藏處理的無水乙醇800μL，放置于4℃10 min左右，讓DNA充分沉淀。（6）小心清除無水乙醇、加入經冰箱冷藏處理70%乙醇漂洗2次。（7）室溫晾干，輕輕彈離心管，至沒有水滴即可。（8）將DNA溶于50μL或100μL的0.1倍TE中，加入RNase （10 mg/mL） 1μL于37℃消化15～30 min。（9）于-20℃或4℃保存。

1.2.2 SSR標記引物序列的獲得及合成通過引物篩選，將多態性豐富且穩定性好的SSR引物用于杏品種（類型）的鑒定及遺傳多樣性分析[24]。

1.2.3 SSR反應體系擴增SSR標記技術反應物混勻后于PCR儀（PTC-200TMPeltiter thermal cycler）上擴增。見表2。

1.3非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測SSR擴增產物，PCR產物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。電泳儀和電泳槽分別使用北京君意東方電泳設備有限公司的JY600C電泳儀和北京市六一儀器廠的DYCZ-30電泳槽。聚丙烯酰胺凝膠溶液的配制見表3。

1.4銀染程序[25]

1.4.1固定將玻璃板從電泳槽取下，拔出梳子，并輕輕將長板取下，膠面朝上放入盛有2000 mL固定液（1800 mL蒸餾水+200 mL無水乙醇+10 mL乙酸）的塑料盒中，在搖床上輕搖7 min。

1.4.2染色倒入2000 mL染色液（2000 mL蒸餾水+3 g AgNO3），在搖床上染色7 min，倒去染色液，用蒸餾水漂洗約30 s。

1.4.3顯色倒入2000 mL顯色液（2000 mL蒸餾水+30 g NaOH+4 mL CH2O），在搖床上輕搖至條帶清晰地顯出，倒去顯色液。

1.4.4定影用步驟1.4.1中回收的固定液定影約30 s。

1.4.5漂洗倒入2000 mL蒸餾水漂洗約30 s。

取出后自然晾干，掃描或照相保存。以上銀染中所用的各溶液需要現配現用，不可久存。

1.5譜帶記錄及數據分析

1.5.1反應條帶觀察及統計凝膠干燥后，形成DNA多態性圖譜，對膠片上的SSR條帶進行量化處理，并以0、1方式記錄。將圖譜上清晰的條帶記為“1”，同一位置沒有條帶記為“0”，生成“1”和“0”組成的原始矩陣。

1.5.2數據分析SSR轉化成1、0數據后，利用NTSYS-2.10e軟件中的SIMQUAL程序求Dice相似系數矩陣：用SHAN程序中的UPGMA方法進行聚類分析。

2結果與分析

2.1 SSR引物篩選

通過引物篩選，將多態性豐富且穩定性好的SSR引物用于杏品種（類型）的鑒定及遺傳多樣性分析，篩選引物組合見表4。

2.2引物篩選鑒定

從18對引物中篩選出6對能將9份材料鑒別出來的具有良好多態性的SSR引物，將9個杏材料歸納鑒定為9個獨立的個體。具體鑒定結果見圖1。

2.3數據聚類分析

采用6對SSR引物對9種杏材料進行鑒定，通過聚類分析將9份材料分為3類（見圖2）。其中杏8（霍城野杏）材料分別為獨立的一類。杏2（樹上干杏2號）、杏3（樹上干杏3號）和杏5（李光杏）聚為一類，而其他5份材料[杏1（樹上干杏1號）、杏4（樹上干杏4號）、杏6（第四師61團古杏）、杏7（鞏留野杏）、杏9（珍珠油杏）]聚為一類，說明這5份材料親緣關系較近，具有較相似的遺傳背景。

SSR標記所構建杏研究材料的指紋圖譜，不受表型特征限制，也不受外部環境影響，本次杏研究材料品種（類型）的鑒定結果為：（1）杏1（樹上干杏1號）、杏2（樹上干杏2號）差異比較大。（2）杏1（樹上干杏1號）、杏4（樹上干杏4號）為一類，其遺傳相似性系數為0.808。（3）與杏1（樹上干杏1號）親緣關系由近到遠依次為鞏留野杏、珍珠油杏、第四師61團古杏，其遺傳相似性系數依次為0.711、0.692、0.673。（4）杏2（樹上干杏2號）、杏3（樹上干杏3號）為一類，其遺傳相似性系數為0.846。（5）杏2（樹上干杏2號）與杏5（李光杏）親緣關系較近，其遺傳相似性系數為0.654。（6）杏8（霍城野杏）為獨立的一類，與杏1（樹上干杏1號）、杏2（樹上干杏2號）親緣關系均較遠。

3討論

中亞地區原始農業的最初階段，天山野果林的各種野生果樹中野杏應該是古人馴化栽培的首選樹種，其栽培品質好，含糖量高，易曬制杏干，杏干是便于貯藏的最佳果品。由此可以推論，在原始農業初期，由于自然條件適宜，人類生活需要，天山野杏曾在古代中國新疆南部烏茲別克斯坦費爾干納及土庫曼斯坦等地首先得到大量種植，然后向東擴展到中國內地，向西拓展到歐洲，但在杏的起源和栽培史中，文獻和史料無此記載。從世界范圍來看，杏的起源、發展、栽培和制干，除廣大中亞地區，包括伊犁河谷及其西南天山的野杏，均具備曬制優質杏干的野杏資源和自然條件外，中國甘肅以東地區和哈薩克斯坦以西的歐洲，由于空氣濕度大，均不具備曬制杏干的自然條件，因此，古代的東方人和西方人應該是首先見到能夠經過長途販運又具有優良品質的杏干，然后才是引種栽培[21]。鑒于樹上干杏1號與鞏留野杏具有較相似的遺傳性判斷其具有相近的親緣關系，再次印證了樹上干杏為伊犁天山野杏中選育而來的說法。至于樹上干杏從伊犁河谷到烏茲別克斯坦迂回傳播的過程還需進一步考證。

SSR標記所構建的杏指紋圖譜，不受表型特征限制，也不受外部環境影響，不僅可用于杏品種（類型）的鑒定，還可為杏品種（類型）的雜合性鑒定提供可靠的方法。樹上干杏2號與李光杏親緣關系近，兩者具有較相似的遺傳背景，不排除芽變或雜交的可能性。

樹上干杏3號與樹上干杏2號品種歸為同一類，樹上干杏4號類型與樹上干杏1號品種歸為同一類，SSR標記反映出的親緣關系與根據生態類型表現對杏種質的分類結果基本一致，其表型差異來源于栽培區域生態差異、土壤差別、管理或遺傳等因素。

參考文獻

[1]趙冰.臘梅種質資源遺傳多樣性與核心種質構建的研究[D].北京：北京林業大學，2008.

[2]張龍進.山茱萸種質資源傳多樣性分析及核心種質構建方法研究[D].西安：陜西師范大學，2012.

[3]楊玉玲，馬祥慶，張木清.ISSR分子標記及其在樹木遺傳育種研究中的應用[J].亞熱帶農業研究，2003，2（1）：18-24.

[4]李保印.中原牡丹品種遺傳多樣性與核心種質構建研究[D].北京：北京林業大學，2007.

[5]文苗苗.黃芩ISSR遺傳多樣性分析及核心種質構建方法研究[D].西安：陜西師范大學，2012.

[6]白錦軍.杏種質資源ISSR標記的遺傳多樣性分析[D].楊凌：西北農林科技大學，2010.

[7]何天明，高疆生，等.分子標記技術在核果類果樹種質資源研究上的應用[J].塔里木大學學報，2005，3：38-43.

[8]俞明亮，馬瑞娟，許建蘭，等.桃種間親緣關系的SSR鑒定[J].果樹學報，2004，21（2）：106-112.

[9]何天明，陳學森，張大海，等.中國普通杏種質資源若干生物學性狀的頻度分布[J].園藝學報，34（1）：17-22.

[10]Graharm J， Menieo R J， Greig K， et al. Identification of redraspberry cultivars and an assessment of the irrelatedness using fingerprints produced by random primers[J]. Hortseienee，1994，69（1）：123-130.

[11]Thomas M R， Cain P， Scottn S. DNA typing of grapevine： a universal methodology and database for describing cultivars and evaluating genetic relatedness[J]. Plant Molecular Biology，1994，25（6）：939-949.

[12]Galli Z， Halasz G， Kiss E. Molecular identification of commercial apple cultivars with microsatellite markers[J]. Horticulture Science， 2005，40（7）：1974-1977.

[13]Jeffreys A J， Wilson V， Thein S L. Individual-specific“fingerprints”of human DNA[J]. Nature，1985，316：76-79.

[14]李雪蓮，王尚德，劉佳棽，等.部分兩用桃品種（系）指紋圖譜的建立[J].西北植物學報，2010，30（3）：0505-0511.

[15]雷天剛，何永睿，吳鑫，等.柑橘栽培品種（系）DNA指紋圖譜庫的構建[J].中國農業科學，2009，42（8）：2852-2861.

[16]Zhbeneyatyeva T N， Reihgdar G L， Gorina V M. Simple sequence repeat （SSR） analysis for assessment of genetic variability in apricot germplasm[J]. Theoretical and Applied Genetics，2003，106（3）：435-444.

[17]Kozhukhova N E， Sivolap Y M. Identification and registration of maize genotypes with the use of molecular markers[J]. Russian Journal of Genetics，2004，40（1）：49-55.

[18]宣繼萍，章鎮，房經貴，等.蘋果品種ISSR指紋圖譜構建[J].果樹學報，2002，19（6）：421-423.

[19]廖康，穎傳杰.新疆特色果樹栽培實用技術（上冊）[M].烏魯木齊：新疆科學技術出版社，2011：209-212.

[20]尚振江，殷洪華，劉剛，等.新疆伊犁河谷樹上干杏調查初報[J].北方果樹，2010（1）：34-35.

[21]林培均，崔乃然.天山野果林資源-伊犁野果林綜合研究院[M].北京：中國林業出版社，2004：141-162.

[22]普通杏品種SSR遺傳多樣性分析[J].園藝學報，2010（37）：23-30.

[23]劉金義，崔海榮，王龍，等.梨果實酸/低酸性狀的SSR分析[J].果樹學報，2011，28（3）：389-393.

[24]方閃閃.仁用杏資源的SSR遺傳多樣性評價[D].石家莊：河北科技大學，2010.

[25]盧彩云.野杏SSR標記多樣性及其與表型性狀的關聯分析[D].沈陽：沈陽農業大學，2018.