啶酰菌胺對向日葵核盤菌生物活性的影響

張海洋 李海燕 孟慶林 何超群 潘文瀚 徐晶宇

摘要：旨在明確新型殺菌劑啶酰菌胺對向日葵核盤菌生物活性的影響，為其推廣應用提供科學依據。以向日葵核盤菌菌絲、孢子和菌核為試材，采用生物測定方法測定啶酰菌胺對向日葵核盤菌菌絲生長、孢子萌發及菌核形成的影響。研究結果表明，啶酰菌胺處理后的核盤菌菌絲生長速率受到抑制，其抑制菌絲生長的EC50為0.2152μg/mL。隨殺菌劑濃度的升高，核盤菌菌絲生長量明顯下降，濃度為16.667μg/mL時，對核盤菌形成菌核數量的抑制率達到84.62%，對核盤菌形成菌核總干重的抑制率達到61.07%。孢子萌發試驗結果表明，啶酰菌胺處理后子囊孢子萌發受到抑制，其抑制子囊孢子萌發的EC50為0.056μg/mL。在濃度為0.267μg/mL時，孢子芽管伸長抑制率達到78.15%。啶酰菌胺不僅對核盤菌菌絲生長有抑制作用，還可以降低子囊孢子的侵入、阻止子囊孢子萌發形成的芽管在植物組織的繼續侵染，有效降低田間土壤中菌核殘留量。對向日葵菌核病的防治前景十分廣闊，可以作為田間防治向日葵菌核病的輪換藥劑。

關鍵詞：向日葵菌核病；啶酰菌胺；核盤菌；菌絲生長；孢子萌發

中圖分類號：S435.655文獻標志碼：A論文編號：cjas20191000226

基金項目：國家特色油料產業技術體系“細菌病害防控”（CARS-14-1-20）。

Effect of Biological Activity of Boscalid on Sclerotinia sclerotiorum of Sunflower Zhang Haiyang1， Li Haiyan1， Meng Qinglin2， He Chaoqun3， Pan Wenhan1， Xu Jingyu1

（1College of Agriculture， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， Heilongjiang， China；

2Institute of Plant Protection， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150000， Heilongjiang， China； 3Heilongjiang Furui Seed Industry Co.， Ltd.， Harbin 150000， Heilongjiang， China）

Abstract： The aims are to clarify the effect of the new fungicide boscalid on the biological activity of Sclerotinia sclerotiorum， and provide a scientific basis for its promotion and application. In this research， we used the hyphae， spores and sclerotia as test samples. Bioassay method was used to confirm the effect of boscalid on mycelial growth， spore germination and sclerotia formation of Sclerotinia sclerotiorum. The results showed that the mycelial growth rate of Sclerotinia sclerotiorum treated with boscalid was inhibited； the EC50 was 0.2152μg/mL. With the increase of germicide concentration， the mycelial growth of Sclerotinia sclerotiorum decreased significantly. When the concentration was 16.667μg/mL， the inhibition rate of sclerotia formation of Sclerotinia sclerotiorum reached 84.62%， and the inhibition rate of total dry weight of sclerotia formation of Sclerotinia sclerotiorum reached 61.07%. The result of spore germination test showed that the germination of ascospores was inhibited after being treated with boscalid， and the EC50 was 0.056μg/mL. The inhibition rate of spore germ tube elongation reached 78.15% at the concentration of 0.267μg/mL. The boscalid not only inhibits the mycelial growth of Sclerotinia sclerotiorum， but also reduces the invasion of ascospores， and prevents the germ cells formed by the germination of ascospores from infecting the plant tissues continuously， which effectively reduces the residual amount of sclerotia in field soil. It has a very broad prospect for the prevention and treatment of sunflower sclerotinia， and can be used as a rotation agent for controlling sunflower sclerotinia in field.

Keywords： Sclerotinia Rot of Sunflower； Boscalid； Sclerotinia Sclerotiorum； Hyphal Growth； Spore Germination

0引言

向日葵是一種菊科向日葵屬一年生高大草本植物，是世界四大油料作物之一[1]，具有良好的耐旱與耐鹽堿性，廣泛分布于中國的東北、西北和華北等地區[2]。向日葵是中國重要的經濟作物，近年來，由于種植業結構的調整和食品加工業需求增加，向日葵種植面積不斷擴大，表現出良好的發展形勢[3]。向日葵菌核病是由核盤菌侵染引起的一種重要的向日葵真菌病害，在中國東北、內蒙古等產區，因菌核病造成向日葵地塊平均發病率達到40%～60%，最高可達到90%以上[4]，嚴重影響著向日葵產量和品質。

核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）是世界性分布的植物病原菌，可侵染多種類型的植物，包括油菜、大豆、向日葵和十字花科蔬菜等[5]。向日葵在生長和發育過程中極易受核盤菌危害而發生向日葵菌核病[6]，菌核病發生嚴重的原因多為向日葵生育期后期多雨，以子囊孢子借風雨傳播的侵染方式為主[7]。向日葵菌核病是世界性范圍的真菌病害，該病一旦發生，難以控制，且發病率逐年上升，甚至造成部分地區向日葵絕收[8]。生產上缺乏對菌核病表現免疫的向日葵育種材料，且菌核在土壤中能夠越冬存活多年，從而導致作物輪作成為問題[9]。目前向日葵菌核病的防治效果仍不理想，生產上該病造成的損失很嚴重。控制向日葵菌核病的主要措施有農業防治、生物防治、化學防治等，化學防治成為防治向日葵菌核病的主要措施[10]。但由于單一藥劑的大量重復使用，在多數產區已有抗藥性產生的報道。Ma等[11]報道中國江蘇省發現核盤菌對二甲酰亞胺類殺菌劑產生抗藥性。任冬梅等[12]表明向日葵菌核病病原菌已對苯丙咪唑類多菌靈、菌核凈產生抗藥性。Zhou等[13-14]研究表明湖南、陜西等地也陸續發現核盤菌產生抗藥性。侯亞光[15]研究表明新疆地區已經發現多菌靈抗性菌株比例為83.4%。抗藥性的產生使向日葵菌核病的防治效果大大降低，為緩解這種現象，生產中亟需篩選具有新的作用方式的有效殺菌劑。啶酰菌胺是一種煙酰胺類殺菌劑，被應用于控制許多作物病害，如白粉病、灰霉病等，具有良好的發展前景[16]。但對菌核病的防治研究報道較少，本研究測定了啶酰菌胺對于向日葵核盤菌的生物活性的影響，明確其對核盤菌菌絲生長、孢子萌發、菌核形成的作用方式。旨在為選擇有效的防治向日葵菌核病的殺菌劑提供依據，有利于制定和實施向日葵菌核病的早期防控措施、科學用藥和持續防控。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株：核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum），采自黑龍江省大慶市，由黑龍江八一農墾大學植物免疫研究室分離所得。

供試藥劑：50%啶酰菌胺可濕性粉劑，巴斯夫（中國）有限公司

1.2方法

1.2.1啶酰菌胺對核盤菌生長的影響菌絲生長速率抑制法：在預試驗基礎上，將殺菌劑加入到PDA培養基中，配成含有效成分16.67、3.33、0.67、0.13、0.027μg/mL 5種濃度的含藥培養基。用d=5 mm的打孔器打取菌碟，每皿含藥的固體平板中央接一個菌碟。每個處理4次重復，等量無菌水作為對照。于25℃恒溫培養箱中培養5天，十字交叉法測量菌落直徑。計算菌落生長抑制率（1），建立毒力回歸方程（2）并根據毒力回歸方程推算出啶酰菌胺對核盤菌的抑制中濃度（EC50）。

菌絲干重法：打取培養3天的核盤菌菌碟放置于含有不同濃度的啶酰菌胺的PD培養基的三角瓶中，每瓶放置10個菌碟，25℃，120 r/min震蕩培養5天后，布氏漏斗抽濾，收集菌絲，剔除菌碟，用蒸餾水沖洗2次并抽濾10 min后烘干稱重，以加等量無菌水作為對照，每個處理4次重復。

1.2.2啶酰菌胺對核盤菌菌核形成的影響打取培養3天的供試核盤菌菌碟，接到含有不同濃度啶酰菌胺的PDA平板上，以加等量無菌水的處理作為對照，每處理4次重復。置于20℃培養箱培養15天后調查菌核數量，收集菌核，烘干后稱重。

1.2.3啶酰菌胺對核盤菌子囊孢子萌發的影響采用孢子萌發抑制法，在預試驗基礎上，將配制的殺菌劑分別加入到制備好的孢子懸浮液中，配成含有效成分0.267、0.133、0.067、0.033、0.017μg/mL 5種濃度，以加等量無菌水的處理作為對照，每處理4次重復。每個處理取20μL置于凹玻片中，再將凹玻片置于保濕的培養皿中，25℃恒溫保濕培養，6 h后顯微觀測孢子萌發情況，每玻片隨機5個視野，不低于100個孢子，同時測量芽管長度，計算對芽管的抑制作用。按公式（3）（4）計算孢子萌發率、孢子萌發抑制率。

1.6數據統計

采用Microsoft Excel 2003進行數據的錄入、整理，DPS統計軟件進行數據分析。

2結果與分析

2.1啶酰菌胺對核盤菌生長的影響

由表1可知，啶酰菌胺對核盤菌菌絲生長速率和菌絲生長量有明顯的抑制作用，且隨啶酰菌胺濃度增大，抑制作用逐漸增強。濃度為0.027μg/mL，菌落生長速率抑制率達到26.45%，菌絲生長量抑制率為5.37%。濃度為16.667μg/mL，菌落生長速率抑制率達到91.68%，菌絲生長量抑制率為55.47%。且不同濃度對核盤菌菌絲生長的抑制均達到顯著或極顯著水平。將藥劑對核盤菌的相對抑制率換算成抑制機率值與藥劑濃度對數進行回歸分析得毒力回歸方程（5），EC50值為0.2152μg/mL。

2.2啶酰菌胺對核盤菌菌核形成的影響

表2數據顯示，啶酰菌胺的濃度越高，對形成菌核數量和干重的抑制作用越大。啶酰菌胺低濃度0.027μg/mL下，形成菌核的數量和干重與對照相比分別降低了18.46%和5.15%，且對核盤菌形成菌核數量的抑制作用大于對菌核干重的抑制作用。啶酰菌胺高濃度16.667μg/mL時，核盤菌形成菌核的數量比對照降低了84.62%，形成菌核的干重與對照相比降低了61.07%。且與對照比均達到極顯著差異。

2.3啶酰菌胺對子囊孢子萌發的影響

啶酰菌胺對核盤菌子囊孢子萌發的影響見表3。由表3可知，啶酰菌胺對核盤菌孢子的萌發和芽管伸長均有明顯的抑制作用。隨著殺菌劑濃度的提高，孢子萌發率逐漸降低，孢子萌發抑制率、芽管伸長抑制率逐漸升高。啶酰菌胺濃度為0.017μg/mL時，孢子萌發率與對照相比降低了11.73%，芽管伸長抑制率為20.85%，孢子萌發抑制率低于芽管伸長抑制率；啶酰菌胺濃度為0.267μg/mL時，孢子萌發率降低88.25%，芽管伸長抑制率達到78.15%，芽管長度和孢子萌發率均與對照差異達到極顯著水平。將藥劑對子囊孢子萌發的相對抑制率換算成抑制機率值與藥劑濃度對數進行回歸分析得毒力回歸方程（6），EC50為0.0563μg/mL。

3結論與討論

隨著向日葵種植面積增加，采取對向日葵菌核病有效的化學防治措施對于確保向日葵產量尤為重要，當前中國對于向日葵菌核病的化學防治研究主要集中在苯并咪唑類殺菌劑、二甲酰胺類和甲氧基丙烯酸酯類。但是，中國各地均已有核盤菌對上述藥劑產生抗藥性的報道，且抗藥性有穩定遺傳的趨勢[17-18]。因此，選擇作用于不同位點、具有不同作用機理的新型殺菌劑是當前化學防治的關鍵。目前對于新型殺菌劑啶酰菌胺的研究主要集中在防治草莓灰霉病和葡萄灰霉病的領域，陳麗萍等[19]報道，啶酰菌胺對草莓灰霉病菌的抑菌效果較好，EC50為2.1504μg/mL；蔣忠洪等[20]研究顯示啶酰菌胺和氟啶胺在一定條件下復配能提高對草莓灰霉病菌的抑菌效果；黃世榮等[21]報道50%啶酰菌胺可以有效防治桑葚菌核病。本研究采用殺菌劑室內生物活性測定的方法探究啶酰菌胺對向日葵核盤菌的抑制活性，結果表明啶酰菌胺對核盤菌的生長有明顯的抑制作用，與王勇[22]、潘以樓等[23]的研究結果一致。

本研究發現，啶酰菌胺對核盤菌子囊孢子萌發的抑制中濃度小于對核盤菌菌絲的抑制中濃度，表明啶酰菌胺對子囊孢子萌發的抑制作用強于對菌絲的抑制作用；子囊孢子是向日葵菌核病的主要侵染源[24]，本研究結果顯示啶酰菌胺對孢子萌發有很強的抑制作用（抑制率88.25%），對核盤菌孢子芽管伸長也有抑制作用（抑制率78.15%），表明啶酰菌胺不僅可以降低子囊孢子的侵入，還可以阻止子囊孢子萌發形成的芽管在植物組織的繼續侵染；菌核是核盤菌在田間越冬的一種特殊的生存結構，本研究顯示啶酰菌胺可以有效抑制菌核產生的數量（抑制率84.62%），并降低產生菌核的干重，預示在田間生產應用中，啶酰菌胺可以降低田間土壤中菌核殘留量，減少隔年的菌核萌發量，從而在根源減少菌核病的發生，對向日葵菌核病的防治前景十分廣闊。

參考文獻

[1]李培江，米瑤，余竟，等.美國引進向日葵種子含油量和脂肪酸組成比較分析[J].中國油脂， 2015，40（11）：104-106.

[2]馬昌盛，王彪，李勇，等.寧南山區食葵與油葵的開花生物學觀察[J].中國蜂業，2017，68（10）：15-17，23.

[3]關洪江.食用型向日葵龍食雜1號選育與栽培技術要點[J].黑龍江農業科學，2009（02）：173-174.

[4]蘭海燕.幾種向日葵菌核病抗性鑒定方法的比較[J].植物保護， 2000（06）：26-28.

[5]李國慶，王道本，周啟，等.核盤菌菌核萌發多樣性的研究[J].植物保護學報，1997（01）：59-64.

[6]馬立功，孟慶林，張勻華，等.向日葵谷胱甘肽-S-轉移酶基因的克隆及抗病功能研究[J].中國油料作物學報，2015，37（05）：635-643.

[7]黃緒堂.向日葵菌核病抗性的遺傳機制與育種研究進展[J].黑龍江農業科學，1999（02）：46-48.

[8]劉秋，于基成，房德純，等.向日葵菌核病的生物學特性研究[J].遼寧農業科學，2000（04）：1-4.

[9]Adams P B， Ayres B E. Ecology of Sclerotinia species. Phytopathology，1979，69：896-899.

[10]孟慶林.向日葵菌核病發生規律及防治技術研究[D].北京：中國農業科學院，2013.

[11]Ma H X， Feng X J， Chen Y， et al. Occurrence and characterization of dimethachlon insensitivity in Sclerotinia sclerotiorum in Jiangsu Province of China[J]. Plant Dis.， 2009，93：36-42.

[12]任冬梅，郭曉利，邢麗萍.向日葵菌核病的防治現狀及前景[J].內蒙古科技與經濟，2010（21）：59-60.

[13]Zhou F， Zhang X L. Dimethachlon resistance in Sclerotinia sclerotiorum in China[J].Plant Dis. 2014， 98：1221-1226.

[14]Zhou F， Zhu F X. First report of dimethachlon resistance in field isolates of Sclerotinia sclerotiorum on oilseed rape in Shaanxi Province of northwestern China[J]. Plant Dis.， 2014，98：568.

[15]侯亞光.向日葵核盤菌致病力分化及菌核形成機制的研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2016.

[16]Avenot H F， Michailides T J. Progress in understanding molecular mechanisms and evolution of resistance to succinate dehydrogenase inhibiting （SDHI） fungicides in phytopathogenic fungi[J]. Crop Protect， 2010，29：643-651.

[17]楊謙.關于核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）對多菌靈抗藥性的研究[J].北方園藝，1993（04）：45-46.

[18]石志琦，周明國，葉鐘音.核盤菌對菌核凈的抗藥性機制初探[J].農藥學學報，2000（02）：47-51.

[19]陳麗萍，吳長興，蒼濤，等.8種殺菌劑對草莓灰霉病菌的室內毒力[J].浙江農業科學，2018，59（09）：1535-1537.

[20]蔣忠洪，王翀，張亞，等.啶酰菌胺和氟啶胺復配物對草莓灰霉病菌的室內毒力測定[J].農業災害研究，2016，6（08）：23-25.

[21]黃世榮，張鵬博.啶酰菌胺等4種新藥劑防治桑椹菌核病效果研究[J].蠶桑通報，2018，49（04）：24-26.

[22]王勇.油菜菌核病菌抗藥性治理及氯啶菌酯與啶酰菌胺的增效減量使用技術研究[D].南京：南京農業大學，2015.

[23]潘以樓，朱桂梅，等.油菜菌核病菌對啶酰菌胺的敏感性及對不同殺菌劑敏感性的相關分析[J].西南農業學報，2012，25（02）：507-512.

[24]鄭露，劉友梅，姜道宏，等.油菜菌核病菌子囊孢子對莖葉的直接侵染研究[J].中國油料作物學報，2015，37（05）：702-706.