利用HRM功能標記檢測黑龍江省水稻抗稻瘟病基因Pita和pik的基因型分布

郭震華 黃翠紅 羅文龍 黃曉群 王瑞英 陳志強 關世武 張淑華 蔡麗君

摘要：為明確Pita及pik基因在黑龍江省水稻種質資源中的分布情況，本研究以67份黑龍江省主栽品種及優異種質資源作為試驗材料，通過HRM技術，利用Pita及pik的HRM功能型分子標記Pita-G/T、Pik2-C/T，對67份材料進行基因分型。結果表明，67份種質中，含純合Pita有27份，占參試種質的40.3%；純合pik有22份，占參試種質的32.9%，同時含有兩基因的為12份，比例為17.9%。綜上，Pita-G/ T及Pik2-C/T標記可以高效準確地對黑龍江水稻資源進行基因分型，同時，通過基因分型，明確了Pita及pik在黑龍江省的分布情況，為抗稻瘟病育種提供了理論基礎。

關鍵詞：水稻；高分辨率熔解曲線；Pita基因；pik基因；基因分型

中圖分類號：S326文獻標志碼：A論文編號：cjas20190900197

基金項目：國家重點研發計劃“寒地早粳稻分子設計育種”（2016YFD0101801）；黑龍江省農科院重大科研成果激勵項目“Pita等抗稻瘟病基因在寒地稻區的分布研究”（2018KYJL001）。

Detection of the Rice Blast Resistance Genes Pita and pik in Heilongjiang： HRM Functional Markers

Guo Zhenhua1，2， Huang Cuihong2， Luo Wenlong2， Huang Xiaoqun1， Wang Ruiying1， Chen Zhiqiang2， Guan Shiwu1， Zhang Shuhua1， Cai Lijun3（1Rice Research Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Jiamusi 154026， Heilongjiang， China；

2National Engineering Research Centre of Plant Space Breeding， Guangzhou 510642， Guangdong， China； 3Jiamusi Branches of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Jiamusi 154026， Heilongjiang， China）

Abstract： To clarify the distribution of Pita gene and pik gene in rice germplasm resources of Heilongjiang， 67 major varieties and excellent germplasm resources were used as materials with HRM （high resolution melting） technology. 67 materials were used for genotyping analysis by Pita-G/T and Pik2-C/T of Pita and pik HRMbased functional markers. The results showed that， among the 67 germplasm resources， 27 germplasm resources contained the homozygous gene Pita （40.3% of the total number）， 22 germplasm resources contained the homozygous gene pik （32.9% of the total number） and 12 germplasm resources contained both of the two homozygous genes （17.9% of the total number）. Based on the results， the functional markers Pita-G/T and Pik2-C/T could be efficiently and accurately used in rice genotyping in Heilongjiang， meanwhile， through genotyping the materials in this research， we clarified the distribution of those two genes in Heilongjiang， which provided a theoretical basis for rice blast resistance breeding.

Keywords： Rice； High Resolution Melting （HRM）； Pita Gene； pik Gene； Genotyping

0引言

稻瘟病是目前影響水稻最為嚴重的一種病害，每年可造成水稻減產11%～30%[1]，嚴重制約著水稻的高產、穩產。黑龍江省作為北方稻區的第一水稻大省，稻瘟病時有發生，危害嚴重，嚴重時可造成減產15%～ 20%。稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe grisea（hebert） barr（無性世代：Pyricularia grisea （cooke） Sacc）引起的[2]，在水稻整個生育期內及各個部位均可發生，其中尤以葉瘟影響最為嚴重。

水稻抗稻瘟病基因的分析最早在日本于20世紀60年代展開，共鑒定了最初的8個抗性位點上的14個基因（JDCs，Japanese differential cultivars）。截至2011年2月，多于75個抗稻瘟病的主效基因已被克隆。其中，包含Pia、Pib、Pita、Pi2、Piz-t、Pi9、Pid2等共18個基因已被成功克?。–hina Rice Data Center ， http：// www. ricedata.cn/gene/gene_pi.htm）。

Pita作為水稻中第2個被克隆的抗稻瘟病主效基因，位于水稻第12染色體的近著絲粒區域，是一個抗譜比較廣的單拷貝顯性基因，在抗病品種和感病品種中都有較低的組成型表達[3]。Jia等[4]利用Pita的DNA序列上的多態性，開發的DNA顯性分子標記YL155/ YL87和YL183/YL87，成功用于Pita基因的鑒定。Pik基因位于水稻第11染色體長臂近末端區域，目前已發現含有5個等位基因，分別是Pik、Pikh、Pikm、Pikp和Piks[5]，其中Pikm、Pikp和Pik己被克隆。此3個基因都為NBS-LRR類抗病基因，且各自均由2個相鄰基因Pikm-1和Pikm-2；Pikp-1和Pikp-2；Pik-1和Pik-2共同作用表現出稻瘟病抗性[6-8]。

高分辨熔解曲線（high–resolution melting curve， HRM）技術作為近年來新興的一種基因分型技術，通過配套的軟硬件系統，可以快速自動監測DNA熔解曲線的變化，實現基因分型，分辨率可達單堿基差異，對SSR、SNP及Indel等不同類型變異有很好的區分效果[9]。由于不需要凝膠電泳等步驟，從而真正實現了閉管操作[10]，避免污染的可能。該方法目前已在玉米[11]、大麥[12]及水稻[13]等農作物中得到很好的應用。羅文龍等[14]針對Pita基因中的G/T SNP位點及Pik、Pikm、Pikp基因中共同存在的C/T SNP，分別開發設計得到Pita及Pik的功能型HRM標記Pita-G/T、Pik2-C/ T，已經在水稻種質基因篩選中得到了很好的應用。筆者擬利用與抗稻瘟病基因Pik和Pita緊密連鎖的HRM分子標記Pita-G/T、Pik2-C/T[14]，對黑龍江水稻種質資源進行基因分型，以期明確Pik和Pita基因在黑龍江水稻中的分布情況，為抗稻瘟病品種的合理利用及選育提供參考，為寒地水稻分子標記輔助選擇育種（MAS）提供物質保障和技術支持。

1材料與方法

1.1材料

選取67份黑龍江省水稻主栽品種及優異種質資源為本研究供試水稻材料（見表1），由黑龍江省農業科學院佳木斯水稻研究所提供，于2014年種植于黑龍江省農業科學院佳木斯水稻研究所試驗地中。

1.2方法

1.2.1水稻基因組DNA提取于水稻苗期對每份水稻材料分別隨機選取3株的新鮮葉片，等量混合，按照文獻[15]中使用的方法進行DNA的提取。

1.2.2用于HRM分析的多重巢式PCR擴增多重巢式PCR共包括以下兩輪擴增反應：

第一輪PCR：2×Power Taq PCR Master Mix母液5μL，外引物F/R （10μmoL/L）各0.3μL，基因組DNA 0.5μL，總體積10μL，ddH2O補足。PCR程序：95℃預變性5 min，35個循環95℃變性20 s，57℃退火20 s，72℃延伸10 s；最后72℃延伸5 min。擴增程序在Gene-Amp9700型PCR儀（Applied Biosystems， USA）上進行。

反應結束后PCR管加200μL雙蒸水，稀釋第一輪產物。

第二輪PCR：2×Power Taq PCR Master Mix母液4μL，內引物F/R （10μmoL/L）各0.3μL，第一輪稀釋PCR產物0.5μL，20×EvaGreen染料（Biotium， USA） 0.5μL，內外標樣各1μL，最后ddH2O補足10μL。擴增程序在Gene- Amp9700型PCR儀（Applied Biosystems， USA）上進行。PCR程序：95℃預變性2 min，22個循環95℃變性20 s，59℃退火20 s，72℃延伸10 s；最后95℃延伸2 min。

1.2.3利用LightScanner96系統HRM分析第二輪

PCR產物中加入20μL礦物油（SIGMA公司），將PCR產物離心轉移至HRM檢測板中，2000 r/min離心2 min，檢查無氣泡，放入LightScanner96高分辨率熔解曲線分析系統（Idaho Technology Inc， USA）進行HRM檢測，起點溫度為60℃，終點溫度為95℃，平均15 min一板PCR反應。反應完成后通過配套的LightScanner Call-IT軟件進行基因型分析，選用Small Amplicon模式進行自動化分析；利用LightScanner分析系統進行HRM檢測。

用于PCR擴增反應的引物名稱、序列、位置及片段大小等詳細信息見表2。

2結果與分析

本研究即利用這2對功能型標記，對黑龍江水稻種質資源進行基因分型。通過兩輪的PCR反應，擴增終產物由于DNA雙鏈上突變位點的退火溫度（Tm值）不同，產生不同的峰值，從而區分不同基因型。

2.1 Pita在黑龍江水稻中的分布情況

Pita基因檢測結果如圖1所示，灰色曲線為堿基為G的稻瘟病感性基因pita，而紅色曲線為堿基為T的稻瘟病抗性基因Pita。可以看出，Pita因T堿基氫鍵多于pita的G堿基，其退火溫度（Tm值）高于pita的，從而產生不同的峰值，區分不同基因型。根據不同材料出現的先后順序，確定出共有27份種質含有純合的抗稻瘟病基因Pita，占參試種質的40.3%，分別為‘龍粳12’、‘龍粳18’、‘五稻8’、‘哈99352’、‘哈99774’、‘龍盾D904’、‘龍稻92001’、‘佳禾早占’、‘松粳5’、‘墾04-488’、‘龍盾306’、‘綏05-6062’、‘龍粳29’、‘北粳0907’、‘龍粳31’、‘龍粳32’、‘龍粳香1號’、‘龍聯1號’、‘龍花07-211’、‘龍花04-350’、‘龍粳39’、‘龍交10-2917’、‘龍交10-989’、‘龍交103970’、‘龍豐09-291’、‘龍生02063-23’、‘zlm55-1’。其余40份為純合的pita基因?？梢姡琍ita抗稻瘟病基因在黑龍江省有著較為廣泛的分布，對黑龍江省抗稻瘟病育種有著重要的作用。

2.2 pik在黑龍江水稻中的分布情況

灰色曲線表示稻瘟病感性基因Pik的DNA熔解曲線，紅色曲線為稻瘟病抗性基因pik的DNA熔解曲線。Pik由于含有C堿基位點，而pik含有T堿基，所以Pik的Tm值低于pik。結果表明，67份種質中，22份種質含有純合的抗稻瘟病基因pik，比例為32.9%，其余45份含純合的Pik基因。此22份種質分別為，‘龍粳18’、‘墾94437’、‘五稻8’、‘哈99352’、‘哈99774’、‘五優稻’、‘佳禾早占’、‘遼380’、‘松粳5’、‘綏05-6062’、‘龍粳38’、‘龍粳29’、‘空育139’、‘龍粳香1號’、‘龍花07-211’、‘中龍香粳1號’、‘糯11-4058’、‘龍交10-989’、‘龍交10-2921’、‘龍豐09-757’、‘龍豐09-291’、‘zsh2907-1’?？梢?，pik抗稻瘟病基因在黑龍江省分布也較為廣泛，同樣可以很好地應用于稻瘟病抗性育種中。

2.3 Pita及pik在黑龍江水稻中共同的分布情況

通過上述分析可以得出，‘龍粳18’、‘五稻8’、‘哈99352’、‘哈99774’、‘佳禾早占’、‘松粳5’、‘綏05-6062’、‘龍粳29’、‘龍粳香1號’、‘龍花07-211’、‘龍交10-989’及‘龍豐09-291’共12份種質同時含有Pita及pik兩種稻瘟病抗性基因，占參試種質的17.9%。

3結論與討論

基于黑龍江省稻瘟病害頻發，且危害性大等特點，水稻抗稻瘟病育種一直以來都是研究的熱點。而目前多數的分子標記輔助育種多集中在常規PCR手段上，而常規PCR技術需要通過凝膠電泳等步驟，實驗步驟多，費時費力，效率偏低。而且輔助選擇主要依賴于與目標基因連鎖的標記進行，存在假陽性的概率較大。隨著分子標記輔助選擇在育種中的廣泛應用，各類分子標記不斷出現，而最為準確的是基于抗性基因本身的序列差異開發的分子標記，稱為功能標記（FMs），能夠直接反映目標性狀的表型，有效避免由于重組引起的遺傳信息的丟失，對FMs的篩選即能對性狀進行篩選[16-18]。HRM技術與常規PCR技術區別主要在于不再需要凝膠電泳步驟，直接對PCR產物在管中進行分析，減少實驗步驟，大大縮短實驗時間，提高實驗效率，同時降低了實驗可能存在的污染率。利用該技術開發的功能標記已在玉米[11]、小麥[19]、大麥[12]及水稻[13]等農作物中都已成功應用。因此，本研究所用到的Pita-G/ T及Pik2-C/T標記是針對基因本身內部SNP位點，利用HRM技術開發得到的，一方面作為功能基因標記，可以準確的發現種質間存在的基因差異，同時，基于HRM技術，又實現了高效快速的優點，可以進行大規模的基因分型及篩查，大大提高了基因檢測及標記輔助選擇的效率。

針對水稻品種稻瘟病抗性而言，單個基因的抗性可能會隨著病原菌生理小種的變化在幾年內逐漸喪失，因此通過聚合育種的方法將多個稻瘟病抗性基因導入同一品種中，即可抵抗多種生理小種的侵害，從而達到廣譜抗性的目的。本研究中‘龍粳29’、‘龍粳香1號’、‘龍花07-211’等12份種質同時聚合Pita及pik抗性基因，對稻瘟病各生理小種有著較為廣泛的抗性，為抗稻瘟病育種研究提供了有利的種質資源。而本研究中所用的資源材料相對仍偏少，為了更好的鑒定分析Pita及pik在黑龍江水稻中的分布情況，需擴大鑒定材料的范圍，更加廣泛的搜集黑龍江水稻種質資源材料，豐富和完善Pita及pik在黑龍江水稻中的分布情況。

目前已定位的主效抗稻瘟病基因中，一半以上是以基因簇的形式存在于水稻各染色體上。Pita基因作為已克隆的顯性單拷貝基因，與Pita2等許多其他抗病基因緊密連鎖，使得該基因具有廣譜抗性，在水稻育種研究及生產上有著較高的實用價值[20]。而目前已知的在Pik基因位點上有5個等位基因，廣泛分布在水稻品種中，具有良好的廣譜抗性。而本研究中通過2個功能性分子標記Pita-G/T及Pik2-C/T對黑龍江部分水稻主栽品種及種質資源展開基因分型，雖然明確了2個基因在這些材料中的分布情況，但仍需明確細化各基因的等位基因的具體分布情況。此外，在基因分型的同時，與之相對應的稻瘟病抗性的表型也需要調查，以此與基因型進行相互印證。

黑龍江省作為北方稻區水稻第一大省，稻瘟病一直以來是嚴重影響水稻產量的第一大病害。對部分黑龍江主栽品種及優異種質資源的Pita及pik基因的分型鑒定，結果表明，67份種質中，含純合Pita有27份，占參試種質的40.3%；純合pik有22份，占參試種質的32.9%，同時含有兩基因的為12份，分別為龍粳18’、‘五稻8’、‘哈99352’、‘哈99774’、‘佳禾早占’、‘松粳5’、‘綏05-6062’、‘龍粳29’、‘龍粳香1號’、‘龍花07-211’、‘龍交10- 989’及‘龍豐09- 291’，占參試材料的17.9%?？梢?，Pita及pik基因在黑龍江分布較廣，對抗稻瘟病品種的選育及抗病基因的合理利用有著重要的參考價值。

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