不同處理方法制作的脂肪組織切片質(zhì)量比較

劉小玲 張偉 趙潔

(1 中國(guó)人民解放軍海軍第971醫(yī)院病理科，山東 青島 266071； 2 青島大學(xué)數(shù)字醫(yī)學(xué)與計(jì)算機(jī)輔助手術(shù)研究院)

日常外科手術(shù)標(biāo)本中有許多是含有脂肪組織的標(biāo)本，在病理組織切片制作過程中，處理好脂肪組織，將會(huì)極大地提高切片質(zhì)量，有利于疾病的正確診斷。但因脂肪組織內(nèi)含有大量不溶于水的脂質(zhì)[1]，這一特性使其在傳統(tǒng)切片制作過程中很難完全置換出來，從而易產(chǎn)生組織破碎、積壓、空洞、缺損等問題，嚴(yán)重影響切片質(zhì)量，給醫(yī)師診斷帶來很大困難。而如果單獨(dú)對(duì)脂肪組織額外進(jìn)行脫水、透明、浸蠟等處理，則會(huì)增加切片處理的時(shí)間與成本。本研究通過對(duì)4種處理方法制作的脂肪組織切片的質(zhì)量進(jìn)行比較，探討較為可行的脂肪組織切片制作方法。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本與來源

收集2019年中國(guó)人民解放軍海軍第971醫(yī)院病理科明確診斷的脂肪瘤組織、乳腺脂肪組織和胃、腸、子宮或腎臟器官根治切除術(shù)中的脂肪組織標(biāo)本共298例。

1.2 儀器與試劑

ASP300S脫水機(jī)、EG1160包埋機(jī)(德國(guó)徠卡公司)以及HM315R切片機(jī)(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司)。

1.3 方法

標(biāo)本均于離體2 h以內(nèi)經(jīng)體積分?jǐn)?shù)0.04甲醛溶液固定24 h后[2]，并按照文獻(xiàn)[3]的方法切成約2.0 cm×1.0 cm×0.1 cm大小的組織塊4塊，分為傳統(tǒng)處理法組(A組)、延長(zhǎng)浸蠟法組(B組)、丙酮脫脂法組(C組)和改良組織脫水處理流程法組(D組)4組。A組標(biāo)本置于ASP300S全自動(dòng)脫水機(jī)中進(jìn)行脫水、透明、浸蠟處理，首先采用體積分?jǐn)?shù)0.75、0.85、0.95、0.95、1.00、1.00、1.00乙醇溶液分別脫水90、90、60、60、60、45、45 min；其次采用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ溶液分別透明30、30 min；最后采用石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ溶液分別浸蠟60、60、60 min。B組將標(biāo)本首先按照A組方法進(jìn)行處理后，浸蠟時(shí)間再延長(zhǎng)8 h[4-5]。C組標(biāo)本在脫水處理之前，先置于丙酮液中于封閉的振蕩器中處理4 h，之后再按照A組方法進(jìn)行處理[6-8]。D組標(biāo)本在進(jìn)行脫水處理過程中，脫水的試劑及作用時(shí)間更改為體積分?jǐn)?shù)0.75、0.85、0.95、0.95、1.00、1.00乙醇溶液和體積分?jǐn)?shù)1.00乙醇溶液與二甲苯(1∶1)混合液分別處理90、90、120、60、60、45和90 min[9]，后續(xù)的透明和浸蠟處理同A組。

將上述4組標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋后，采用輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)進(jìn)行4 μm厚切片，然后40～42 ℃下于攤片機(jī)中攤片，70 ℃下烤片15 min[2]，最后進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。以臨床技術(shù)操作規(guī)范切片質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)切片的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估[10]。

2 結(jié) 果

光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，A組切片的優(yōu)良率為40.9%(122/298)，切片存在破碎嚴(yán)重、脂肪細(xì)胞破裂、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)對(duì)比不鮮明等問題(圖1A)；B組切片優(yōu)良率為43.0%(128/298)，切片的質(zhì)量與A組相近(圖1B)；C組和D組切片優(yōu)良率分別為98.7%(294/298)和99.0%(295/298)，切片厚薄均勻、平整、無皺褶、無刀痕，且脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，染色清晰，透明度好(圖1C、D)。4組切片的優(yōu)良率比較差異具有顯著性(χ2=462.827，P<0.001)；C組與D組切片的優(yōu)良率均顯著高于A組與B組(χ2=223.666～238.973，P<0.001)；而A組與B組之間、C組與D組之間切片的優(yōu)良率比較差異均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A～D分別為A組、B組、C組和D組，HE染色，10倍

3 討 論

臨床病理工作中常見脂肪組織標(biāo)本，在切片制作過程中，處理好脂肪組織對(duì)提高切片質(zhì)量和疾病正確診斷率具有重要意義。在脂肪組織切片傳統(tǒng)處理流程中，對(duì)脂肪組織發(fā)揮脫脂作用的主要是高濃度的乙醇溶液[11]。但是乙醇溶液脫脂速度比較緩慢[12-13]，一般需要12 h以上才能脫脂完全[14]，但高濃度乙醇溶液實(shí)際處理的時(shí)間僅有4.5 h，只能置換出極少量脂肪組織；同時(shí)脂肪組織不溶于水，高濃度乙醇溶液不能置換出脂肪內(nèi)的水分，也會(huì)影響脫水效果[15]。組織在脫水不徹底的情況下再采用二甲苯進(jìn)行透明處理時(shí)，透明效果不佳[15]。在浸蠟處理過程中也不利于組織與石蠟之間的相互滲透[15]，最終造成制片困難。因此，以傳統(tǒng)方法處理的脂肪組織標(biāo)本，經(jīng)脫水、透明和浸蠟處理后再進(jìn)行切片時(shí)易出現(xiàn)破碎、散片現(xiàn)象，鏡下觀察時(shí)也會(huì)出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)不清、細(xì)胞斷裂的問題，從而影響對(duì)疾病的診斷[16]。

研究顯示延長(zhǎng)浸蠟法制作的切片完整性與傳統(tǒng)方法相近[4]。但由于傳統(tǒng)處理方法未能對(duì)標(biāo)本中的脂肪組織完全溶解，致后期浸蠟效率降低，最后脂肪細(xì)胞呈現(xiàn)空泡狀[4]，通過再增加8 h的浸蠟時(shí)間，以石蠟來支撐和填充空泡狀的脂肪細(xì)胞，以達(dá)到保持其正常形態(tài)的效果[4]。

本研究中C組切片優(yōu)良率較A組顯著增高。丙酮有快速脫脂功能[5-7]，并可溶于水、醇、氯仿等試劑中，因此在脂肪組織脫水前先進(jìn)行脫脂處理，提高了切片的質(zhì)量。需要注意的是，丙酮脫脂法制作的切片質(zhì)量好壞，主要取決于標(biāo)本是否固定充分[17]。如果固定不充分就進(jìn)行脫脂處理，則會(huì)導(dǎo)致脂肪組織變脆，切片時(shí)出現(xiàn)脂肪空泡破碎、攤片散片等現(xiàn)象，致使制片失敗。

但在近期的大量研究中又發(fā)現(xiàn)，乙醇溶液只能使脂肪組織逐步滲透脫水，真正溶解脂肪組織的試劑是二甲苯[9]，因此有學(xué)者又提出改良脫水處理法[9]，即脂肪組織在脫水處理之后和透明處理之前，先以乙醇和二甲苯(1∶1)混合液進(jìn)行處理。由于二甲苯不溶于水，所以將其置于脫水處理之后；同時(shí)二甲苯令脫水后的脂肪迅速溶解，從而促進(jìn)了體積分?jǐn)?shù)1.00乙醇溶液的滲透；體積分?jǐn)?shù)1.00乙醇與二甲苯溶液協(xié)同交替作用，達(dá)到邊脫水，邊溶脂的功效。此種方法使得脂肪或有脂肪包裹的組織得到充分脫水與透明，亦保證了石蠟的有效浸透，使切片的完整性得到明顯提高[9]，從而得到效果比較滿意的切片。

本研究在此改良脫水處理的基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床工作實(shí)踐，對(duì)脫水處理流程又進(jìn)行了調(diào)整。首先將體積分?jǐn)?shù)1.00乙醇和二甲苯(1∶1)混合液由原來的45 和60 min兩次處理更改為該混合液的一次處理90 min[9]，時(shí)間縮短了15 min；同時(shí)又增加了一次體積分?jǐn)?shù)1.00乙醇和一次二甲苯的處理[18]，結(jié)果顯示脫脂效果更好，切片優(yōu)良率達(dá)到99.0%。

綜上所述，丙酮脫脂法與改良脫水處理流程法制作切片優(yōu)良率高于傳統(tǒng)處理法和延長(zhǎng)浸蠟法，易于疾病的病理診斷；但丙酮脫脂法試劑準(zhǔn)備較為繁瑣，而改良脫水處理流程法無需額外試劑準(zhǔn)備，更省時(shí)省力，是一種非常實(shí)用的脂肪組織處理方法，值得在各醫(yī)院推廣、使用。