結核分枝桿菌Rv2991、Rv3428c重組蛋白對菌陰肺結核的輔助診斷價值

胡建平 韓俊壘 邊紅芝

(河南省胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450002)

在2019年的世界衛(wèi)生組織的報告中，全球已有1 000萬(900萬～1 100萬)人患有結核病，其中因病死亡率為132/10萬，且以低收入及中等收入國家占比最多[1]。我國屬于結核病高負擔國家，近幾年隨著結核病防治工作的展開，國內(nèi)活動性肺結核患病率雖有下降，但整體的患病情況依然并不樂觀[2]。結核病的早期診斷與控制依然是國內(nèi)工作重點。結核病防治的關鍵是早期和準確地確診[3]。目前我國結核病診斷方法多參照世界衛(wèi)生組織所推薦的細菌學診斷技術，即痰涂片與細菌培養(yǎng)[4]。但這兩種診斷技術均易受痰樣本質量與結核分枝桿菌菌體結構的影響，檢測的靈敏度偏低，因此尋找靈敏度與特異度均更為理想的診斷方法極為必要[5]。目前血清學診斷多被用于多種疾病的早期診斷[6]，也已有研究初步探討該檢測方法針對結核病診斷的特異度與靈敏度[7]。菌陰肺結核是指1次痰培養(yǎng)、3次痰涂片結果均為陰性的肺結核，這類肺結核相對特殊，因診斷缺乏金標準，故早期非常容易誤診和漏診，故對于這類患者可以考慮應用血清學方法診斷檢出[8-9]。Rv2991、Rv3428c是新發(fā)現(xiàn)的結核分枝桿菌重組蛋白抗原，本研究旨在探討結核分枝桿菌Rv2991、Rv3428c重組蛋白輔助診斷菌陰肺結核的價值，為菌陰肺結核的血清學診斷提供參考。現(xiàn)將結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2016年3月—2018年5月我院收治的初治菌陰肺結核患者100例(A組)，同期在我院接受治療的其他肺部疾病患者100例(B組)及行常規(guī)全身體檢健康者100例(C組)作為對照。3組研究對象年齡均≥18歲，A組均為菌陰肺結核患者，符合《肺結核診斷和治療指南》[10]中菌陰肺結核診斷標準；B組經(jīng)細菌學檢查確診為非結核病患者，但有咳痰、咯血等肺結核主要臨床癥狀。A組男61例，女39例；年齡27～65歲，平均(40.21±10.11)歲；體質量44～77 kg，平均(60.21±10.20)kg；受教育程度：初中及以下37例，中專或者高中40例，大專及以上23例。B組男60例，女40例；年齡28～65歲，平均(41.41±10.39)歲；體質量45～75 kg，平均(59.12±9.20)kg；受教育程度：初中及以下40例，中專或高中38例，大專及以上22例。C組男65例，女35例；年齡26～65歲，平均(39.47±10.07)歲；體質量45～78 kg，平均(60.44±10.31)kg；受教育程度：初中及以下38例，中專或高中36例，大專及以上26例。3組性別、年齡、體質量、受教育程度等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，全部納入者對研究內(nèi)容均知情，并簽署知情同意書。排除標準：合并惡性腫瘤疾病者，心、肝、腎等重要臟器功能不全者，意識障礙或精神疾病等無法很好地配合研究者，合并血液系統(tǒng)疾病者，合并免疫疾病者，參加本次研究的同時還參加其他相關研究者。

1.2 主要儀器與試劑

質粒pET-28a、大腸桿菌DH5a、BL21(DE3)感受態(tài)細胞系本室保存，其感受態(tài)細胞由本課題組制備。Rv2991、Rv3428c蛋白全基因及引物由華大基因公司合成。DG3022A酶標儀、洗板機購買于美國BIO-RAD公司，ND-1000型蛋白測量儀購買于美國Nano Drop公司。內(nèi)切酶及其他酶類購買于大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、小量質粒提取試劑盒、微量蛋白定量試劑盒、辣根過氧化物酶標記羊抗人IgG、顯色液等購買于北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1引物設計與目的基因擴增 上下游引物設計：上游引入酶切位點，下游將終止子去掉并引入酶切位點。然后以結核分枝桿菌標準株H37Rv基因組DNA作為模板，在DNA擴增儀上進行基因擴增，條件：94 ℃預變性5 min后；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min終止反應，使用PCR試劑盒回收目的基因。

1.3.2表達工程菌pET28a-Rv2991以及pET28a-Rv3428c的構建 對目的基因及載體質粒進行雙酶切，回收產(chǎn)物后加入連接酶過夜。取連接產(chǎn)物轉接至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，在38 ℃的條件下培養(yǎng)過夜；將過夜后長出的細菌菌落接種至液體培養(yǎng)基中，搖晃提取質粒，使用內(nèi)切酶行雙酶切鑒定，鑒定成功后送至實驗室完成測序驗證，獲得表達工程菌pET28a-Rv2991和pET28a-Rv3428c。

1.3.3Rv2991、Rv3428c重組蛋白的原核誘導表達以及純化 將表達工程菌pET28a-Rv2991以及pET28a-Rv3428c轉接至含有50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)，誘導表達約8 h，離心收集菌體，并進行超聲破碎。提取總蛋白后，進行 SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的表達形式。采用美國GE公司的AKTA純化流程進行純化，蛋白純化后使用微量BCA蛋白定量試劑盒檢測各Rv2991、Rv3428c重組蛋白的表達水平。操作嚴格參照試劑盒說明書進行。

1.3.4酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定受試者血清吸光度值 采集受試者入組次日清晨空腹靜脈血5 mL，1 h內(nèi)3 300 r/min離心10 min分離血清，立即分裝并于-70 ℃冰箱保存，所有樣本無反復凍融，并在3個月以內(nèi)完成檢測。使用棋盤滴定法檢測Rv2991、Rv3428c重組蛋白血清最佳稀釋度與最佳包被濃度，使用酶標儀讀取450 mm波長處的各血清樣本的吸光度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 3組受試者血清中Rv2991、Rv3428c重組蛋白表達水平比較

3組受試者的血清中結核分枝桿菌Rv2991、Rv3428c重組蛋白表達水平比較差異具有顯著意義(F=649.451～2 156.945，P<0.05)，其中A組患者血清中結核分枝桿菌Rv2991、Rv3428c重組蛋白表達水平高于B、C組(q=43.381～81.529，P<0.05)，B組與C組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 3組受試者血清結核分枝桿菌Rv2991、Rv3428c重組蛋白表達水平比較

2.2 Rv2991、Rv3428c重組蛋白用于菌陰肺結核輔助診斷的效能

將B組作為對照，繪制ROC曲線，血清當中的Rv2991、Rv3428c重組蛋白輔助診斷菌陰肺結核的曲線下面積分別為0.834(95%CI=0.778～0.895)、0.829(95%CI=0.771～0.884)，同時cut-off值分別為58 000.50和48 500.50，并且在該值之下，血清中Rv2991、Rv3428c重組蛋白輔助診斷菌陰性肺結核的靈敏度分別為92.3%和81.5%，特異度則分別為85.5%和82.0%。見圖1a、b。

3 討 論

目前，我國結核病以患病率高、感染率高、不同地區(qū)間患病率差異大為主要特點[11]，在全部結核病患者中，菌陰肺結核發(fā)病率、誤診漏診率、病死率均較高[12]。菌陰肺結核是指痰涂片抗酸桿菌及痰培養(yǎng)分枝桿菌結果均為陰性的結核病，屬于活動性肺結核，在全部肺結核患者中占比超60%[13-14]。結核病前期多經(jīng)細菌學檢測來確定傳染源[15]，同時細菌學檢測也是結核病治療的主要的依據(jù)[16]。然而細菌學檢測易受諸多因素影響，早期診斷的特異度與靈敏度相對較低[17]。目前，諸多檢查手段的出現(xiàn)與使用使得菌陰肺結核的前期診斷有所提高，尤其是血清免疫學與分子基因學等諸多檢測手段的使用，為菌陰肺結核的早期診斷帶來突破[18]。

a：Rv2991重組蛋白，b：Rv3428c重組蛋白

本研究分析Rv2991與Rv3428重組蛋白在菌陰肺結核中的表達，并將其用于菌陰肺結核患者的輔助診斷，旨在觀察兩者用于菌陰肺結核診斷的價值。結核分枝桿菌Rv2991與Rv3428重組蛋白均是結核分枝桿菌特異性抗原，能夠引起機體的細胞與體液免疫，是機體重要的免疫原[19-20]。但因兩者均是最近才發(fā)現(xiàn)的免疫原，故將其用于菌陰肺結核診斷是否有一定價值尚無相關報道。既往的研究報道證實，結核分枝桿菌特異抗原可用于結核病的血清學輔助診斷，且診斷的特異度及靈敏度均較高，是迄今可以作為單項檢查用于結核病診斷的最佳抗原之一，也是目前商品化試劑盒中被廣泛使用的一種抗原[21-23]。Rv2991與Rv3428c均是經(jīng)仿生親和、免疫層析、蛋白分離純化、蛋白免疫原性生物信息學分析及表位預測等技術篩選出的新的且在臨床檢驗中具有實際應用價值的重要免疫標志物[24]。前者是以pET28a作為載體，與相關的抗原構建充足質粒，并轉化至菌株內(nèi)，利用原核表達，對目的蛋白進行純化，成功獲得誘導的純化表達抗原[25]。本研究結果顯示，Rv2991、Rv3428抗原作為一種重組蛋白，在A組表達最高，其次為B組，C組表達最低；進一步繪制ROC曲線，以B組作為對照，驗證其用于菌陰肺結核輔助診斷的效能，結果顯示Rv2991重組蛋白診斷菌陰肺結核的曲線下面積為0.834，cut-off值為58 000.50，在該吸光度58 000.50值下，Rv2991重組蛋白輔助診斷菌陰性肺結核的靈敏度和特異度分別為92.3%和85.5%，曲線下面積值與診斷靈敏度、特異度均較高，有著較高的診斷價值。Rv3245c是RD11區(qū)典型基因，近幾年該區(qū)抗原在肺結核疫苗研制方面的價值有一定報道[26]，RD11區(qū)Rv3245與Rv3428c編碼的重組蛋白均能夠引起小鼠γ-干擾素水平表達升高，表明Rv3428c抗原在結核病的診斷中也具有一定研究價值，可以作為融合抗原用于肺結核疫苗的研制[27-30]。本研究結果顯示，3組受試者中A組血清中Rv3428c表達水平最高，其次為B組，C組水平表達最低；進一步繪制ROC曲線，以B組作為對照，驗證其用于菌陰肺結核輔助診斷的效能，結果顯示Rv3428c重組蛋白輔助診斷菌陰肺結核的曲線下面積為0.829，cut-off值為48 500.50，在該cut-off值下，Rv3428c重組蛋白輔助診斷菌陰性肺結核的靈敏度和特異度分別為81.5%和82.0%，曲線下面積與特異度均處于較高水平，提示Rv3428c輔助診斷菌陰肺結核有著較高的應用價值。但是目前國內(nèi)外關于結核分枝桿菌Rv2991、Rv3428c重組蛋白用于輔助診斷菌陰肺結核的研究報道較少，故本研究結論尚沒有循證醫(yī)學相關的證據(jù)支持，還應在未來開展大樣本、長時間的研究中加以驗證。

綜上所述，結核分枝桿菌Rv2991、Rv3428c重組蛋白用于菌陰肺結核的輔助診斷有著較高的特異度與靈敏度，具有一定的臨床應用的價值。