傷寒沙門氏菌質粒DNA參考物質的研制

努色熱提·阿布都沙拉木 袁慕云 林曉峰 許龍巖★ 陳瑤★

沙門菌（Salmonella，Sa）屬于腸桿菌科，在世界各國細菌性食物中毒病例中，其引起的食物中毒常居榜首或第二位［1-2］。沙門氏菌的血清型有超過2 500 中，腸炎沙門菌（Salmonella enteritidis，SE）和鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium，ST）感染占到人類Sa 感染患者的75%以上［3-4］。因此，快速鑒定并確定沙門氏菌的型別，對食品安全具有重要的意義。

目前沙門氏菌的檢測方法在快速發展中，聚合酶鏈式反應（PCR）等核酸檢測技術的發展在一定程度上克服了傳統檢測方法耗時長、操作復雜、特異性差等缺點。但是目前用于PCR 的核酸檢測參考品十分缺乏。要同時進行沙門氏菌的鑒定和型別分析，往往要使用多個基因組參考品才能完成，而基因組參考品中檢測靶基因的量值，又難于確定和溯源［4-5］，也無法就不同實驗室的檢驗結果進行對比和評價。為此，本實驗擬制備含可用于鑒定和鑒別沙門氏菌型別的基因片段的質粒DNA 參考樣品，為沙門氏菌核酸檢測提供可溯源的有效參考物質，有效解決病原菌核酸檢測能力快速發展與標準物質缺乏的矛盾。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

菌株來源為沙門氏菌標準菌株（CMCC50071），鼠傷寒沙門菌標準菌株（ATCC14028），腸炎沙門菌標準菌株（ATCC13076）（來自中國普通微生物菌種保藏管理中心廣州海關技術中心）。全基因人工合成等（上海吉瑪生物工程有限公司）；引物合成、DNA 測序（華大基因科技股份有限公司）。

1.2 片段設計和克隆

通過人工合成的方法將沙門氏菌aceA基因（GenBank：U43344.1），SE 特異性序列se（Gen-Bank：AF370707.1），ST 特異性序列st（GenBank：CP001363.1）以1∶1 的比例串聯在一起（單個基因的核酸序列可從https：//www.ncbi.nlm.nih 下載，基因之間以不相關的基因片段aagtcg 隔開），并克隆到pUC57 中以形成重組質粒pDNASalmonella，并進行擴增純化后用于進一步實驗。

1.3 質粒純度測定

使用瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度分析法（UV 法）判定質粒純度。取10 μL 酶切液上樣，用1% 瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察條帶是否清晰且單一以判斷核酸純度。取1 μL 樣品通過UV 法測出樣品在260 nm、280 nm 波段的紫外光下的吸光度值（A260、A280），純DNA 的A260/A280 應為大于1.8，小于2.0 的值。

1.4 均勻性檢測

取樣按照《JJG1006-1994 一級標準物質技術規范》進行使用紫外法（UV 法）（最小采樣量為1 μL）分析pNDA 的瓶間均勻度和瓶內均勻度。

隨機選擇10 管pDNA，并從每管樣品的上層，中層和下層提取1 μL 測試樣品，根據方差分析（F-測試）瓶內均勻性。隨機選擇10 管pDNA，并用UV 重復測量每管中提取的1 μL 樣品3 次，取平均值。通過方差分析（F 檢驗法）分析測量結果并進行判斷瓶間均勻性。并根據ISO 指南35 使用該數據評估pDNA 分裝導致的均勻性對不確定度的貢獻。

1.5 穩定性考察

選擇最常見的保藏方法-20℃低溫保存作為穩定性考察的指標，每月隨機抽取3 瓶對質粒DNA參考物質的濃度進行測定，為期一年，并根據ISO指南35 使用該數據評估長時間保存的穩定性并評估穩定性對核酸參考物質不確定度的貢獻。

1.6 定值

pDNA 采用8 家實驗室協同定值的方法進行標準值的確定，匯總全部原始數據后經統計檢驗確認各組數據無離群值、各組數據等精度、每組數據的平均值之間不存在顯著性差異后，取8 家實驗室檢測結果的平均值為各質粒DNA 標準物質的標準值，并進行定值過程引入的不確定度。

1.7 不確定度評估

根據對pDNA 均勻性、長期穩定性、定值結果這三方面來源的不確定度最終計算出標準物質的標準不確定度及擴展相對不確定度。在計算擴展不確定度的時候，將標準不確定度乘以包含因子（k=2）。

1.8 qPCR 實驗

根據沙門氏菌基因組大小3.29 Mbp，pDNA 大小5 179 bp，按照以下公式估算基因組DNA 和重組質粒DNA 的拷貝數。

定量后，使用pDNA 和gDNA 分別制備10 倍稀釋系列，制備2×106、2×105、2×104、2×103、2×102和2×101copies/mL 稀釋的樣品用于建立qPCR 標準曲線。qPCR 每個反應均含10 pM 引物。PCR 方案如下：分別在94℃下10 min 和94℃下15 s，在58℃下45 s 進行40個循環。引物序列和擴增子大小如表1。

分別將質粒參考品（pDNA）和基因組DNA（gDNA）稀釋成106、105、104、103、102和101copies/mL 用作參考樣品，并一式三份進行qPCR 檢驗，以估計qPCR 檢測的擴增效率（e）和斜率（K）。以101拷貝為檢測樣本進行10 次qPCR 檢測，以估計檢測下線（Limit of detection，LOD）來評估qPCR的檢測范圍。通過統計分析標準曲線的擴增效率（e）和斜率（K），以評估pDNA 對gDNA 的可替換性。

1.9 數據分析統計分析

使用SPSS 12.0 和Graphpad 5.0 軟件進行統計分析。均勻性測試使用單因素方差分析。穩定性分析使用單向線性回歸分析來計算斜率b1，當|b1|＜t00.95，n-2×S（b1）時將認定未觀察到不穩定性［（n-2 是自由度），而S（b1）是斜率的不確定性］。使用配對t檢驗分析pDNA 與gDNA 的適用性結果。當P＜0.05 具有統計意義。

表1 三種沙門氏菌檢測所需的引物序列和來源Table 1 Sequence and source of Primers for salmonella

2 結果

2.1 質粒標準品

測序結果提示成功合成了含有基因的DNA片段，并將其插入克隆載體和pUC57 中，形成了重組質粒pDNA（圖1）。pDNA 提取純化后，經酶切鑒定和測序證實，重組質粒中插入片段的序列準確度為100%，符合預期（圖2）。鑒定后的質粒通過紫外法測定其A260/A280的比值為1.926±0.436，比值在1.8-2.0 間，且A260/A230的比值大于2.0。

圖1 pDNA Salmonella 質粒構建示意圖Figure 1 Map of plasmid reference material pDNA Salmonella

圖2 pDNA Salmonella 質粒鑒定圖Figure 2 Identification of pDNA Salmonella

2.2 均勻性檢驗

均勻性檢測結果顯示，在95%置信水平下，pDNA 的性質值在瓶內和瓶內均質性上差異無統計學意義。見表2。

表2 鼠腸炎傷寒沙門氏菌核酸標準樣品均勻性評價結果Table 2 Statistic results of homogenous test of pDNA Salmonella

根據以下公式計算質粒DNA 的瓶間不均勻性引起的不確定度（uh）：

其中：Q1為組間差方和，Q2為組內差方和，v1為組間自由度，v2為組內自由度，n為組內測量次數。

根據上述公式計算得出，pDNA 瓶間不均勻性引起的不確定度結果為：0.586 μg/mL。

2.3 穩定性檢驗

pDNA 在-20℃低溫保存條件下用經驗模型線性回歸模型進行穩定性評價的結果，結果表明穩定性線性模型中的斜率|β1|＜t0.95，n-2·S（β1），表明pDNA 具有良好的穩定性。根據以下公式計算質粒DNA 在12 個月內的長期穩定性引起的不確定度（us）。見表3。

表3 pDNA 長期穩定性的統計結果Table 3 Statistic results of short-term stability of pDNA Salmonella

us=Sβ1×N

其中：β1是穩定性線性模型中的斜率，S（β1）是斜率的標準偏差，N 是穩定性評估的總時間，N=12 個月最終經過計算得出pDNA 在長期保存12 個月所引起的不確定度為：1.616 μg/mL。

2.4 定值結果

pDNA 的參考值由8 個實驗室共同確定，并通過統計檢查證實，每組數據均沒有異常值和顯著差異，并得出總的平均值=30.08 μg/mL 作為標準值；進而根據以下公式計算定值過程帶來的不確定度：

其中：s 為總平均值的標準偏差1.016 μg/mL，p 為實驗室數目。

因此得出由定值產生的不確定度結果為：0.359 2 μg/mL

2.5 不確定度分析

質粒DNA 參考材料的不確定度成分為：均質性（uh）、有效期內變異性引起的不確定度（us）、定量過程引入的不確定度（uq），因此根據以下公式計算標準不確定度：

結果為：1.796 6 μg/mL。計算擴展不確定度時，應將標準不確定度乘以包含因子（k=2）。所以，擴展相對不確定度計按以下公式計算：

U=Ucrm*k

最終計算得到擴展不確定度（U）為3.5932 μg/mL（k=2）。圖3。

2.6 熒光定量PCR（qPCR）標準曲線的建立

使用所制備的pDNA 作為參照標準以建立qPCR 標準曲線，各標準曲線的相關參數。見表4、圖3。

表4 沙門氏菌pDNA 建立的標準曲線數據Table 4 Data for the standard curve established by pDNA Salmonella

圖3 沙門氏菌pDNA 建立的aceA，st，se 基因的標準曲線Figure 3 Standard curve of aceA，st，se sequence established by pDNA Salmonella

2.7 pDNA 和基因組DNA 標準品的替代研究

此研究中使用了以梯度稀釋的傷寒沙門菌基因組DNA（gDNA）和pDNA 參考材料為模板繪制標準曲線，并統計分析標準曲線的擴增效率和斜率（t 檢驗）。在95%置信度下，基因組DNA 建立的標準曲線與pDNA 建立的標準曲線之間，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5。

3 討論

為了能夠提供為多個檢測靶標進行定性定量參考的參考品，本研究針對沙門菌的aceA基因、腸炎沙門菌特異序列st、鼠傷寒沙門菌的特異性序列se，通過人工合成方法制備了質粒核酸檢測參考品。pDNASalmonella的制備解決了需要鑒別沙門氏菌的型別的時候，需要使用多種基因組核酸參考品的問題，通過一次熒光PCR 擴增就可以確認檢測樣本是否受到沙門菌以及哪一種沙門菌的污染。在提供有保障的序列和量值溯源的同時，大大簡化了操作的繁瑣性［4-7］。實驗結果表明，pDNASalmonella不僅具有序列和量值的可溯源性，還具有良好的穩定性及均一性，符合《一級標準物質技術規范》要求［8-10］。本文進一步根據歐盟核酸參考品Yieldgard MON 810 的研究方 法［11-13］證明了pDNASalmonella替換基因組DNA 的可行性，提示在制備方法和安全性上具有巨大優勢的人工合成質粒DNA 參考品有望替代基因組參考品應用于沙門氏菌的核酸檢驗。

表5 副溶血弧菌pDNA 和基因組DNA 標準品代替性研究Table 5 Substitution of pDNA Salmonella and genomic DNA reference material

本研究為人工合成質粒作為病原菌核酸檢測參考品的應用提供了實踐基礎。下一步工作，我們將進一步驗證此方法是否也可更廣泛的用于食品中其他危險病原體的檢測，例如Ecoli O157，副溶血性弧菌和霍亂弧菌等，并希望通過提供優質的可溯源性參考品有效提高病原體測試實驗室相關項目的檢測水平并確保其可比性，從而提高應對大規模突發公共安全事件的能力儲備。