白內(nèi)障患者NOS、DPP及TFAR19蛋白的表達(dá)及臨床意義

張紅振 王二麗 朱樂(lè)如

白內(nèi)障為世界致盲疾病之首，隨著我國(guó)人口老齡化加劇，白內(nèi)障患病率逐年升高。如何防治白內(nèi)障，保護(hù)白內(nèi)障按患者視力成為眼科醫(yī)生研究的熱點(diǎn)。既往研究表明，自由基氧化損傷會(huì)加重晶狀體氧化損傷程度，但其對(duì)白內(nèi)障患者影響的相關(guān)研究結(jié)果尚未完善［1-2］。二肽基肽酶（DIPEPTIDYL peptidase，DPP）在細(xì)胞死亡及蛋白降解中發(fā)揮重要作用，有學(xué)者研究指出先天性白內(nèi)障大鼠晶狀體中DPP 的表達(dá)會(huì)明顯高于正常對(duì)照組大鼠，且晶狀體渾濁程度更高［3］。凋亡相關(guān)蛋白19（apoptosis-associated protein19，TFAR19）已被較多學(xué)者證實(shí)與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，但其與白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系鮮有報(bào)道［4-5］。本研究將深入探討白內(nèi)障患者外周血中NOS、DPP 及TFAR19蛋白的表達(dá)情況及臨床意義，為臨床診治白內(nèi)障提供理論依據(jù)。現(xiàn)研究報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月至2018年5月本院收治的64例白內(nèi)障患者的臨床資料進(jìn)行整理、分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均為初次確診為白內(nèi)障的患者，年齡在52～78 歲之間；②納入研究之前未進(jìn)行白內(nèi)障摘除術(shù)或其他藥物治療；③均在入院后行白內(nèi)障囊外摘切除術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并青光眼、高度近視、眼外傷等其他眼部疾病者；②代謝性白內(nèi)障、過(guò)熟期白內(nèi)障患者；③糖尿病病程長(zhǎng)達(dá)5年的患者；④精神障礙無(wú)法配合治療者。

根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究最終納入符合標(biāo)準(zhǔn)的64 例白內(nèi)患者設(shè)為觀察組。其中男38 例，女26 例；平均年齡（60.41±2.58）歲；皮質(zhì)性白內(nèi)障26例，核性白內(nèi)障20 例，后囊下性白內(nèi)障18 例，健康組中男34 例，女30 例，平均年齡（60.21±2.47）歲。另選上述患者除去病變部位外的正常組織為對(duì)照組。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情并簽署同意書。

1.2 方法

兩組均于入院或次日清晨空腹抽取靜脈血4 mL，4℃保存，自然凝固后以3 000 r/min 離心10 min，分離血清標(biāo)本，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ悦嘎?lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中NOS 水平。試劑盒由上海江萊食物科技有限公司提供，檢測(cè)儀器為美國(guó)產(chǎn)的ELX808 酶標(biāo)儀。

以免疫組化化學(xué)SP 染色測(cè)定DPP、TFAR19蛋白水平，兔抗人多克隆抗體DPP 及TFAR19 由美國(guó)Beckman Coulter 公司提供。將摘除眼球后極部鞏膜組織常規(guī)石蠟切片，梯度水化，抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶修復(fù)，4℃室溫孵育過(guò)夜，PBS 洗滌，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物，PBS 洗滌，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。顯微鏡下觀察DPP、TFAR19。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

DPP 及TFAR19 蛋白陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)［6］：腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。陽(yáng)性細(xì)胞占比：0 分（無(wú)陽(yáng)性，無(wú)色）；小于30.00%（1分，淡黃色）；大于等于30.00%（2 分，棕黃色），3 分（棕褐色）。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比小于26%為1 分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比26%～50%為2 分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比51%～75%為3 分，陽(yáng)性細(xì)胞壁大于75%為4 分；根據(jù)兩者相乘結(jié)果進(jìn)行評(píng)判：小于3分（-）、3 分（+）、4 分（++）、5 分（+++）。陽(yáng)性率=陽(yáng)性例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 觀察指標(biāo)

①對(duì)比觀察組與對(duì)照組血清NOS 水平及DPP、TFAR19 蛋白表達(dá)情況，并分析白內(nèi)障組NOS、DPP、TFAR19 的表達(dá)與患者臨床特征之間的關(guān)系。②觀察患者術(shù)后視力恢復(fù)情況，以術(shù)后3 個(gè)月視力結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)視功能問(wèn)卷（visual function，VF）［7］評(píng)估患者術(shù)后視力恢復(fù)情況。該問(wèn)卷包括主觀視覺(jué)、周邊視野、視覺(jué)適應(yīng)、立體視覺(jué)4 個(gè)指征，依據(jù)患者主觀感覺(jué)從無(wú)困難到嚴(yán)重困難分為4級(jí)，得分1～4 分，總分0～100 分。視力正常或接近正常：VF 評(píng)分大于等于60 分；視力損傷：VF 評(píng)分在60 分以下。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；影響患者視力預(yù)后的相關(guān)因素采用非條件單因素和多因素Logistic回歸分析；以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOS、DPP及TFAR19在兩組中的表達(dá)情況比較

觀察組NOS 水平、DPP 及TFAR19 陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

表1 NOS、DPP 及TFAR19 在兩組中的表達(dá)情況［（n）%，（±s）］Table 1 Comparison the expressions of NOS，DPP and TFAR19 in the two groups［（n）%，（±s）］

表1 NOS、DPP 及TFAR19 在兩組中的表達(dá)情況［（n）%，（±s）］Table 1 Comparison the expressions of NOS，DPP and TFAR19 in the two groups［（n）%，（±s）］

組別觀察組對(duì)照組t/χ2值P 值n 64 64 NOS（ng/mL）1.58±0.30 1.23±0.22 7.526 0.001 DPP陽(yáng)性46（71.88）14（21.87）32.125 0.001陰性18（28.12）50（78.13）TFAR19陽(yáng)性40（62.50）18（28.12）15.259 0.001陰性24（37.50）46（71.88）

圖1 免疫組化染色圖（SP，×500）Figure 1 Immunohistochemical staining（SP，×500）

2.2 NOS、DPP 及TFAR19 表達(dá)與白內(nèi)障患者臨床特征的相關(guān)性

NOS、DPP 及TFAR19 的表達(dá)與白內(nèi)障患者年齡呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與患者性別、不同類型、合并糖尿病、合并高血壓之間無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 影響白內(nèi)障患者術(shù)后矯正視力預(yù)后的單因素分析

通過(guò)分析影響白內(nèi)障患者術(shù)后矯正視力預(yù)后的單因素，發(fā)現(xiàn)：性別、不同類型、合并高血壓為非影響白內(nèi)障患者術(shù)后視力預(yù)后的單因素（P＞0.05）；年齡、合并糖尿病、NOS、DPP、TFAR19為影響患者術(shù)后矯正視力預(yù)后的單因素（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 NOS、DPP 及TFAR19 表達(dá)與白內(nèi)障患者臨床特征的相關(guān)性Table 2 Correlation between expression of NOS，DPP and TFAR19 and clinical features of cataract patients

表3 影響白內(nèi)障患者術(shù)后矯正視力預(yù)后的單因素分析Table 3 univariate analysis on the prognosis of postoperative corrected visual acuity in cataract patients

2.4 影響白內(nèi)障患者術(shù)后視力預(yù)后的多因素分析

選取有條件的單因素經(jīng)非條件多因素Logistic回歸模型進(jìn)一步分析，得出：年齡（≧65 歲）、NOS表達(dá)（高水平）、DPP 表達(dá)（陽(yáng)性）、TFAR19 表達(dá)（陽(yáng)性）影響白內(nèi)障患者術(shù)后視力預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 影響白內(nèi)障患者術(shù)后視力預(yù)后的多因素分析Table 4 multivariate analysis of visual acuity prognosis in cataract patients

3 討論

白內(nèi)障為老化、遺傳、環(huán)境等因素引起的晶狀體代謝紊亂，晶狀體蛋白變形而變渾濁，嚴(yán)重影響患者的視力，該病的發(fā)生及發(fā)展的確切機(jī)制至今尚未明確。相關(guān)研究結(jié)果表明，白內(nèi)障的發(fā)生與晶狀體氧化損傷之間聯(lián)系密切，其中以自由基對(duì)晶狀體的損傷最為嚴(yán)重［8］。但由于直接檢測(cè)患者機(jī)體內(nèi)的自由基較為困難，NOS 為促進(jìn)自由基合成的限速酶，臨床多采用檢測(cè)NOS 來(lái)間接反映自由基含量［9］。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清中NOS，并使用免疫組化化學(xué)染色的方法檢測(cè)DPP、TFAR19，分析其與患者臨床特征及術(shù)后視力預(yù)后之間的關(guān)系。

有學(xué)者研究報(bào)道NOS 在眼部脈絡(luò)膜、睫狀體、視網(wǎng)膜等各個(gè)組織均有表達(dá)，但正常生理情況下呈低表達(dá)狀態(tài)［10］。本研究結(jié)果顯示，觀察組NOS水平高于對(duì)照組，DPP 及TFAR19 陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，這一研究結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似［11］。既往文獻(xiàn)報(bào)道，白內(nèi)障患者晶狀體中的NOS 表達(dá)會(huì)高于無(wú)眼部疾病者［12］。NOS 參與正常生理狀態(tài)下自由基的合成，在機(jī)體處于病理狀態(tài)時(shí)，可受內(nèi)毒素、白細(xì)胞介素-1 等介質(zhì)刺激，產(chǎn)生大量一氧化氮合酶，生成過(guò)量的自由基并發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)［13］。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，白內(nèi)障患者NOS 的過(guò)度表達(dá)與白內(nèi)障病變相關(guān)。DPP 是定位于囊泡系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)溶酶體蛋白酶，早期有學(xué)者報(bào)道，從豬、大鼠等動(dòng)物的晶狀體中檢測(cè)出DPP［14］。Herman 等［15］指出，DPP 存在于嚙齒動(dòng)物的晶狀體中。XU 等［16］采用免疫組化染色法，檢測(cè)到DPP 存在有睫狀體無(wú)色素上皮細(xì)胞、晶狀體上皮細(xì)胞、晶狀體纖維層等結(jié)構(gòu)中，由此推測(cè)DPP 的表達(dá)與白內(nèi)障的發(fā)生有關(guān)。TFAR19 是最早由北京大學(xué)發(fā)現(xiàn)的一種與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的蛋白質(zhì)，存在于人體50 多種組織，是參與細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程的重要蛋白質(zhì)。

本研究通過(guò)分析NOS、DPP、TFAR19 與患者臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)年齡與白內(nèi)障患者上述指標(biāo)的表達(dá)有顯著相關(guān)性。考慮為年紀(jì)越大的患者機(jī)體老化程度加速及局部營(yíng)養(yǎng)障礙嚴(yán)重，會(huì)加大白內(nèi)障的發(fā)生幾率，從而刺激NOS、DPP、TFAR19表達(dá)。但由于本研究已排除合并糖尿病病程長(zhǎng)達(dá)五年的患者，因此在本研究中合并糖尿病僅為影響白內(nèi)障患者手術(shù)矯正視力預(yù)后的單因素而非獨(dú)立危險(xiǎn)因素，代謝性疾病對(duì)白內(nèi)障患者術(shù)后視力預(yù)后的影響還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，NOS、DPP、TFAR19 在白內(nèi)障患者中呈高表達(dá)，NOS、DPP、TFAR19 表達(dá)與患者年齡有密切聯(lián)系，上述指標(biāo)表達(dá)過(guò)高會(huì)影響患者手術(shù)矯正視力預(yù)后。但由于本研究納入樣本量較少，且未進(jìn)行其前瞻性研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果難免存在偏倚，相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)與白內(nèi)障發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。