GPC-1、miRNA-9及Caspase-3在肺腺癌中的表達及與病情和預后生存的相關性

智雅婧 馮鐵虹 那順孟和 鄭媞

肺腺癌惡性程度高，是臨床臨床診治困難的疾病之一。目前肺腺癌的發生及病程中相關分子機制的認識尚不夠深入，因此尋找新的生物標志物對提高肺腺癌的診斷率，對改善患者預后意義重大。磷脂酰肌醇蛋白聚糖（glypicans，GPC）是一類由蛋白質、糖和脂質組成的復雜的復合物，有學者研究報道其與惡性腫瘤的發生、發展存在密切聯系［1］。隨著較多學者對微小RNA（microRNA，miRNA）的探究的，發現miRNA-9 在腫瘤的發生及發展中發揮重要作用［2］。有學者發現天冬氨酸特異性半膚氨酸蛋白酶（Cysteinyl Aspartatespecific Proteninases，Caspase）是細胞凋亡的中心環節，目前在哺乳動物中已發現14 種亞型［3］。本研究旨在探討GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 在肺腺癌中的表達及與病情、預后生存的相關性，現研究報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年8月至2017年8月本院收治的76 份肺腺癌患者標本為觀察組，其中男39 例，女37；平均年齡（60.51±3.57）歲；根據TNM 分期，可分為Ⅰ期～Ⅱ期33 例，Ⅲ～Ⅵ期43 例。選取上述患者遠離3cm 的肺腺癌的癌旁正常組織76 分標本作為對照組。所有患者知情同意。整理并分析其臨床資料。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本實驗經醫院倫理委員會批準同意。

納入標準：①均經術后病理檢查及術前影像檢查確診為肺腺癌［4］；②納入研究前未接受過放、化療等輔助治療；③年齡在51～78 歲之間。排除標準：①合并其他惡性腫瘤及重要器官嚴重疾病者；②因精神障礙無法配合治療者；③阿爾茲海默癥者。

1.2 GPC-1、Caspase-3 檢測方法

免疫組化法：標本經常規石蠟切片、脫水，加入酒精、自來水沖洗、顯色、復染、脫水中性樹膠封固。在顯微鏡下觀察GPC-1、Caspase-3，檢測過程嚴格按照說明進行，檢測完成后由2 位高年資醫師采用雙盲法閱片。

1.3 miRNA-9 檢測方法

取出組織標本置于新的EP 管家1 mLTrizol 裂解液。離心、取上清留取2 μL 用于RNA 質量檢測，其余RNA 溶液放置-80℃冰箱備用。總RNA特異的莖環引物反轉錄按照反轉錄試劑盒說明書配置。采用逆轉錄-聚合酶鏈反應提取兩組組織中的RNA，miRNA-9 序列：5′-GTTATCTAGCTGTATGAGTGCC-3′。樣品做3 個平行孔，取其均數。相對表達量以2-ΔΔCt計算［5］。ΔΔCt=（Ct 目的基因-Ct管家基因）實驗組-（Ct 目的基因-Ct 管家基因）對照組。

1.4 試劑選擇

兔抗人GPC-1 多克隆抗體由北京博奧森生物技術公司提供；Caspase-3 鼠抗人單克隆抗體采購自美國Neo Markers 公司；miR-9mimics 及所用引物購自中國廣州銳博生物科技有限公司。

1.5 結果判定

GPC-1、Caspase-3 陽性判斷標準［6］：腫瘤細胞胞質或細胞核中出現棕黃色或棕褐色顆粒。陽性細胞占比：0 分（無陽性）；＜30.00%（1 分）；≥30.00%（2 分）。染色強度評分：0 分（無色）、1 分（淡黃色）、2 分（棕黃色）、3 分（棕褐色）。陽性細胞＜26%為1 分，陽性細胞占比26%～50%為2 分，陽性細胞占比51%～75%為3 分，陽性細胞＞75%為4 分；根據兩者相乘結果進行評判：小于3 分（-）、3 分（+）、4 分（++）、5 分（+++）。陽性率=陽性例數/總例數×100%。miRNA-9 正常范圍值：2.35～4.62 ng/mL［7］。

1.6 隨訪

本研究隨訪（患者自行來院復查）從患者術后開始，直至患者死亡或本研究的隨訪結束，為期3年，截止于2020年8月?；颊叩碾S訪時間分布在1 至36 個月，平均隨訪時間為（20.10±2.64）個月。

1.7 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數據統計分析，計數資料用n（%）表示，采用χ2檢驗；繪制ROC 曲線，Kaplan-Meier 生存分析GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 表達對患者預后生存的影響，以tarone 法進行檢驗；影響患者預后的相關因素采用Logistic回歸分析；以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 在不同組織中的表達

肺腺癌組織中GPC-1、Caspase-3 陽性表達及miRNA-9 高表達率高于癌旁正常組織（P＜0.05）。見表1，圖1。

表1 GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 在不同組織中的表達［n（%）］Table 1 expression of GPC-1，mirna-9 and Caspase-3 in different tissues［n（%）］

圖1 免疫組化染色圖（×500）Figure 1 immunohistochemical staining（×500）

2.2 肺腺癌組織中GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3表達與患者病情進展的關系

GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 表達情況與肺腺癌患者年齡、性別、分化程度、腫瘤直徑、血管侵犯無關（P＞0.05）。見表2。

表2 肺腺癌組織中GPC-1、miRNA-9、Caspase-3 表達與患者病情進展的關系Table 2 Relationship between the expression of GPC-1，mirna-9，Caspase-3 in lung adenocarcinoma and the progression of patients

2.3 肺腺癌患者不同GPC-1、miRNA-9及Caspase-3表達的預后情況

納入的76 例肺腺癌患者3年生存率為35.53%（49/76），GPC-1 陽性表達、miRNA 高表達、Caspase-3 陰性表達的肺腺癌患者死亡率更高（P＜0.05）。見表3。

表3 肺腺癌患者不同GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 表達的預后情況［n（%）］Table 3 Prognosis of lung adenocarcinoma patients with different expression of GPC-1，mirna-9 and caspase-3［n（%）］

2.4 GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 表達與肺腺癌患者預后的關系

GPC-1 表達陰性及表達陽性中位生存時間分別為（36.01±2.26）個月、（30.22±1.71）個月；miRNA-9 高表達及低表達中位生存時間分別為（29.69±1.40）個月、（35.86±2.63）個月；Caspase-3 表達陰性及表達陽性中位生存時間分別為（27.42±1.66）個月、（34.51±1.96）個月。生存分析顯示GPC-1（表達陰性）、miRNA-9（低表達）、Caspase-3（陽性表達）者生存期較長，Keplan-meier 生存曲線明顯不同（P＜0.05）。見圖2。

2.5 影響肺腺癌患者預后生存的單因素和多因素分析

圖2 生存曲線Figure 2 survival curve

臨床分期（Ⅲ～Ⅵ期）、有淋巴結轉移、GPC-1 表達（陽性）、miRNA（高表達）及Caspase-3 表達（陰性）為影響肺腺癌患者預后生存的獨立危險因素（P＜0.05）。見表4。

3 討論

肺腺癌早期無典型癥狀，且尚無特異且敏感的標志物，絕大多數的患者無法及時確診，因此耽誤最佳治療時機，即使患者得到手術根治，也需要面臨高復發率和轉移率的風險。如何提高肺腺癌的早期診斷率，改善預后為當前肺腺癌治療亟待解決的難題。

國外研究發現［8］，GPC-1、Caspase-3 在肺腺癌組織中陽性表達率有較大差異，本研究發現在肺腺癌組織中GPC-1 陽性表達率、Caspase-3 陰性表達率、miRNA-9 高表達率均明顯高于癌旁正常組織?？紤]與納入樣本量不同有關，免疫組化抗原修復方式也存在差異，可能會導致研究結果存在一定偏差。

相關研究指出［9］，GPC-1 與肺腺癌相關，GPC-1陽性表達與肺腺癌淋巴結的侵襲和轉移有關，其在肺腺癌發生過程中起到一定作用。本研究證實GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 的表達與TNM 分期、淋巴結轉移有關。

表4 影響肺腺癌患者預后生存的單因素和多因素分析Table 4 univariate and multivariate analysis of prognostic factors in patients with lung adenocarcinoma

GPC-1 在生長發育和癌變過程中起關鍵作用，Xue F［10］等學者研究指出，GPC-1 在非癌組織中無表達或表達量極低，但在癌組織中呈高表達狀態。Szychowski KA［11］等指出，GPC-1 在肝癌、胰腺癌等惡性疾病中陽性表達率較高。miRNA-9是是一種古老的小分子RNA，有較多研究發現其在乳腺癌、胃癌等腫瘤中呈異常表達，且參與了腫瘤的生長及轉移，而由于腫瘤類型和下游作用靶點的不同miRNA-9 可作為促癌基因也可作為抑癌基因［12～13］。本研究發現miRNA-9 高表達中位生存時間明顯短于miRNA-9 低表達者，提示其在肺腺癌中作為促癌基因發揮作用，促進了癌細胞的增值和擴散。Caspase-3 以低活性酶原形式廣泛存在于細胞中，TNM 分期Ⅲ～Ⅵ的的肺腺癌患者Caspase-3 表達下調，可見Caspase-3 表達降低可能與參與腫瘤發生、發展的過程［14～15］。

本研究中肺腺癌患者3年生存率為僅35.53%，生存分析顯示，生存分析顯示GPC-1（表達陰性）、miRNA-9（低表達）、Caspase-3（陽性表達）者生存期較長，提示：GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 的異常表達與肺腺癌患者預后相關。經非條件多因素Logistic 回歸模型進一步分析，再次肯定GPC-1、miRNA、Caspase-3 這三者在肺腺癌發生、發展及預后評估中的價值。但由于本研究本研究研究年限較短，且納入樣本量較少，研究結果難免存在偏倚，GPC-1、miRNA、Caspase-3 這三者聯合檢測是否有望成為更敏感且準確的指標仍有待研究。

綜上所述，GPC-1、miRNA、Caspase-3 異常表達與肺腺癌患者病情進展密切相關，且不利于患者預后。提示臨床工作者可通過加強監測這三項指標，以了解肺腺癌患者疾病進展情況，以評估患者預后。