動脈瘤性蛛網膜下腔出血患者外周血miR-210與TLR4表達的相關性及臨床意義

陳明 張清秀 魏秀娥★

動脈瘤性蛛網膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH）是臨床常見的腦血管意外，致殘率高、危害大。腦血管痙攣（cerebral vasospasm，CVS）是aSAH 常見的并發癥，表現為顱內動脈收縮并造成腦組織缺血，是造成aSAH 遲發性神經功能損害及預后不良的主要原因。炎癥反應是目前已知與aSAH 及CVS 發病機密切相關的環節，有基礎研究報道，抑制炎癥反應能夠改善SAH 大鼠的CVS［1］；臨床研究報道，全身炎癥反應指數對aSAH 患者發生CVS 具有預測價值［2-3］。但是，aSAH 及CVS 發病過程中炎癥反應的調控機制尚不十分清楚。微小RNA（microRNA，miR）是一族在轉錄后水平調節基因表達的非編碼RNA，具有廣泛的生物學作用，在神經系統中發揮保護或損傷作用。miR-210 是一種具有神經保護作用的miR，王立新的動物實驗發現過表達miR-210 能夠改善SAH 大鼠的CVS，同時抑制Toll 樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）的表達并減少多種炎癥細胞因子的釋放［4］。但miR-210/TLR4 周在SAH 及CVS 發病中的變化并未見報道。將檢測了外周血中miR-210 及TLR4 的表達水平并分析其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2015年6月至2019年6月期間本院收治的55 例aSAH 患者作為研究組，其中男性31 例、女性24 例，年齡（51.92±10.77）歲；另取同期體檢的70 例健康志愿者作為對照組，其中男性39 例、女性31 例，年齡（48.12±12.24）歲。所有患者及家屬均已知情并同意。兩組間一般資料的比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

納入標準：①發病后24 h 內入院；②符合aSAH的診斷標準［5］；③發病后3d 內進行早期手術；④留取外周血用于miR-210 及TLR4 的檢測；⑤臨床資料完整。排除標準：①既往有腦梗死、腦出血、腦外傷病史；②合并其他神經系統疾病或精神性疾??；③術前存在CVS；④住院期間死亡。本實驗經醫院倫理委員會批準。

1.2 外周血miR-210 及TLR4 表達的檢測

取aSAH 患者入院當天的外周血樣本及對照組志愿者體檢當天的外周血樣本，采用北京天根公司的試劑盒進行miR-497 表達的檢測。首先采用全血RNA 提取試劑盒提取RNA。用miR 熒光定量PCR 檢測試劑盒檢測miR-210 的表達水平；采用熒光定量PCR 檢測試劑盒檢測TLR4 的表達水平。

1.3 血清炎癥細胞因子含量的檢測

取aSAH 患者入院當天的血清樣本及對照組志愿者體檢當天的血清樣本，采用酶聯免疫吸附法試劑盒（上海酶聯公司）檢測白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質金屬蛋白酶-9（MMP9）的含量。按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 aSAH 患者CVS 及預后的評估

參照指南［5］進行CVS 及預后評估。aSAH 患者術后第7 天時或出現新發局灶性神經功能缺損癥狀時，進行經顱多普勒超聲檢查，大腦中動脈血流速度≥120 cm/s 認為發生CVS。術后6 個月時采用改了Rankin 量表（mRS）評估神經功能，mRS 評分0～2 分為預后良好、3～6 分為預后不良。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行數據分析，計量資料（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，相關性采用Pearson 檢驗分析，采用ROC 曲線分析miR-210 及TLR4 預測預后及CVS 的價值。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血miR-210 及TLR4 表達的比較

aSAH 組患者外周血中miR-210 的表達水平低于對照組，TLR4 的表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組外周血miR-210 及TLR4 表達的比較（±s）Table 1 Comparison of miR-210 and TLR4 expression in peripheral blood between 2 groups（±s）

表1 兩組外周血miR-210 及TLR4 表達的比較（±s）Table 1 Comparison of miR-210 and TLR4 expression in peripheral blood between 2 groups（±s）

組別aSAH 組對照組t 值P 值n 55 70 miR-210 0.79±0.25 1.00±0.28 4.361 0.000 TLR4 1.33±0.38 1.00±0.25 5.837 0.000

2.2 aSAH 組患者外周血miR-210 與TLR4 的相關性

aSAH 組患者外周血miR-210 的表達水平與TLR4 的表達水平具有負相關關系，差異有統計學意義（r=-0.469，P＜0.05）。見圖1。

圖1 aSAH 組患者外周血miR-210 與TLR4 的相關性Figure 1 Correlation between miR-210 and TLR4 in aSAH group

2.3 兩組血清炎癥因子含量的比較

aSAH 組患者血清中IL-6、TNF-α、MMP9 的含量高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組血清IL-6、TNF-α、MMP9 含量的比較（±s）Table 2 Comparison of serum IL-6，TNF-α and MMP9 between two groups（±s）

表2 兩組血清IL-6、TNF-α、MMP9 含量的比較（±s）Table 2 Comparison of serum IL-6，TNF-α and MMP9 between two groups（±s）

組別aSAH 組對照組t 值P 值n 55 70 IL-6（pg/mL）47.69±12.59 36.51±9.24 5.724 0.000 TNF-α（ng/mL）8.39±1.94 6.44±1.52 6.303 0.000 MMP9（ng/mL）18.82±3.65 13.04±2.26 10.867 0.000

2.4 aSAH 組患者外周血miR-210、TLR4 與血清炎癥因子的相關性

aSAH 組患者外周血miR-210 的表達水平與血清中IL-6、TNF-α、MMP9 的含量具有負相關關系（P＜0.05），外周血TLR4 的表達水平與血清中IL-6、TNF-α、MMP9 的含量正相關關系，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 aSAH 組患者外周血miR-210、TLR4 與血清炎癥因子的相關性Table 3 Correlation between miR-210，TLR4 and serum inflammatory factors in aSAH group

2.5 aSAH 組中CVS 與非CVS 患者外周血miR-210 及TLR4 表達的比較

aSAH 組中CVS 患者外周血中miR-210 的表達水平低于非CVS 患者，TLR4 的表達水平高于非CVS 患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 aSAH 組中CVS 與非CVS 患者外周血miR-210及TLR4 表達的比較Table 4 Comparison of miR-210 and TLR4 expression in peripheral blood between CVS and non CVS patients in aSAH group

2.6 外周血miR-210、TLR4 預測aSAH 患者CVS的ROC 曲線分析

外周血miR-210、TLR4 預測aSAH 患者CVS的ROC 曲線下面積分別為0.723（95%CI：0.564～0.992、P=0.008）、0.722（95%CI：0.569～0.874、P=0.008），根據約登指數最大確定最佳截斷值分別為0.74、1.26。見圖2。

圖2 miR-210、TLR4 預測aSAH 患者CVS 的ROC 曲線Figure 2 ROC curve of miR-210、TLR4 predicting CVS in aSAH patients

2.7 aSAH 組中預后良好與預后不良患者外周血miR-210 及TLR4 表達的比較

aSAH 組中預后不良患者外周血中miR-210的表達水平低于預后良好患者，TLR4 的表達水平高于預后良好患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 aSAH 組中預后良好與預后不良患者外周血miR-210 及TLR4 表達的比較（±s）Table 5 Comparison of miR-210 and TLR4 expression in peripheral blood between patients with good prognosis and poor prognosis in aSAH group（±s）

表5 aSAH 組中預后良好與預后不良患者外周血miR-210 及TLR4 表達的比較（±s）Table 5 Comparison of miR-210 and TLR4 expression in peripheral blood between patients with good prognosis and poor prognosis in aSAH group（±s）

CVS 情況CVS 患者非CVS 患者t 值P 值n 20 35 miR-210 0.64±0.27 0.87±0.20 3.605 0.001 TLR4 1.58±0.37 1.19±0.30 4.257 0.000

2.8 外周血miR-210、TLR4 預測aSAH 患者預后的ROC 曲線分析

外周血miR-210、TLR4 預測aSAH 患者預后的ROC 曲線下面積分別為0.741（95%CI：0.588～0.894、P=0.003）、0.789（95%CI：0.659～0.918、P=0.001），根據約登指數最大確定最佳截斷值分別為0.77、1.26。見圖3。

圖3 miR-210、TLR4 預測aSAH 患者預后的ROC 曲線Figure 4 ROC curve of miR-210、TLR4 predicting prognosis of patients with aSAH

3 討論

aSAH 的致殘率高，CVS 是造成aSAH 患者神經功能損害并致殘的常見并發癥。CVS 的臨床表現是顱內動脈收縮造成受累腦組織供血減少、出現缺血缺氧性神經功能損害，進而影響aSAH 的預后［6-7］。因此，早期評估aSAH 病情、預測可能發生CVS 的高危人群并盡早進行干預，有助于預防CVS、改善預后。但目前aSAH 及CVS 的發病機制尚不十分清楚，闡明相關發病機制不僅能夠為尋找新的病情評估標志物提供參考，還能為發現新的治療手段提供靶點。

炎癥反應在aSAH 及CVS 發病中的作用受到越來越多關注，炎癥反應的激活一方面加重腦水腫、促進神經元氧化應激及凋亡并造成神經功能損害，另一方面誘導腦血管發生痙攣并加重神經功能損害［8-9］。TLR4 通路是體內參與炎癥反應調控的重要信號通路，多項基礎研究證實TLR4 介導的炎癥反應與aSAH 神經功能損害、CVS 發生均密切相關［10-11］。miR-210 在中樞神經系統中發揮保護作用［12-13］。國內一項基礎研究發現，過表達miR-210 用于SAH 大鼠的治療能夠減輕神經損害、改善CVS 并抑制TLR4 的表達［4］，表明miR-210 靶向TLR4 可能參與aSAH 及CVS 的發病。本研究結果發現：aSAH 患者外周血中miR-210 的表達水平降低、TLR4 的表達增加且具有負相關關系，miR-210 低表達可能削弱其抑制TLR4表達的作用并造成TLR4 表達增加，進而參與aSAH 的發病。

TLR4 是調控炎癥反應的重要信號通路，發生激活后通過NF-κB 途徑啟動下游IL-6、TNF-α、MMP9 等炎癥基因的表達，引起IL-6、TNF-α、MMP9 大量釋放［14］。已有研究報道［15-16］，aSAH 患者血清中IL-6、TNF-α、MMP9 的含量異常增加，本研究的分析結果與其一致，及aSAH 患者血清中IL-6、TNF-α、MMP9 的含量高于對照組。本實驗結果表明miR-210/TLR4 軸參與aSAH 發病過程中炎癥反應的調控，miR-210 靶向TLR4 并抑制炎癥反應。

國內多項炎癥反應與aSAH 及CVS 相關的臨床研究證實，炎癥反應指數對aSAH 的預后及CVS 均具有預測價值［1，17］；王立新的動物實驗則證 實了miR-210 對SAH 大鼠TLR4 表達及CVS 的抑制作用。本研究已經證實aSAH 患者miR-210/TLR4 軸發生改變且與炎癥反應的激活存在相關性，為了進一步闡明miR-210/TLR4 軸在aSAH 發病中的作用，本研究對aSAH 患者CVS 及預后進行了評估，55 例aSAH 患者中發生CVS 18 例、預后不良20 例，CVS 發生率和預后不良發生率分別為32.73%、36.36%，相應的發生率與國內已有研究相似。在此基礎上分析miR-210、TLR4 表達與CVS、預后的關系可知：發生CVS 及預后不良患者外周血中miR-210 的表達降低、TLR4 的表達增加，經ROC 曲線分析證實miR-210、TLR4 對CVS 和預后具有預測價值。

綜上所述，aSAH 發病過程中miR-210 表達降低、TLR4 表達增加與炎癥反應的激活、CVS 及預后不良的發生有關，miR-210/TLR4 可能在aSAH發病中起重要作用，未來miR-210、TLR4 有望成為評估aSAH 病情及預后的標志物，過表達miR-210并抑制TLR4 介導的炎癥反應則有望成為治療aSAH、改善預后的新靶點。