呼出氣冷凝液、血清和組織中miRNA34a檢測對非小細胞肺癌患者的價值探討

陶國華 孫蘋蘋 陳金亮 陳建榮★

肺癌是人類危害最大的惡性腫瘤，其發病率和死亡率在世界上高居榜首。2019年國家癌癥中心報告：2015年數據統計結果肺癌位居我國惡性腫瘤發病首位，占城市和農村惡性腫瘤死亡第一位［1］。肺癌根據病理類型可分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）兩大類，肺癌中80%～85%是非小細胞肺癌［2-3］。微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）是一類非編碼小分子RNA，miRNA 作為一類重要的參與基因表達調控的分子，代表了一種新的基因表達調控模式，它在細胞中調節約30%的蛋白編碼基因，在致病過程中起著重要作用［4］。迄今為止，活檢是肺癌患者診斷參考標準。不幸的是組織活檢是一個有限制的過程，如難以進入不同的腫瘤部位，具有侵襲性和患者依從性低等缺陷［5］。呼出氣冷凝液（exhaled breath condensates，EBC）是一種檢測呼吸道生化成分的新技術。EBC 來自幾乎所有的呼吸細胞類型，包括結構細胞和免疫細胞。EBC 作為呼吸道氣道內襯液體含有多種生物分子，如DNA，RNA，蛋白質，代謝物和揮發性化合物。它作為一種新的非侵入性采集的樣品，正逐漸受重視。目前為止，對于腫瘤組織和血液中miRNAs 的研究報道較多，而EBC 中的相關研究較少。本研究將探討NSCLC 患者EBC中miRNA34a 的相對表達水平和血清中CEA、CYFRA21-1 的含量，其表達量與臨床的相關性，并評價其在NSCLC 中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月至2017年12月在本院呼吸科和胸外科接受治療并經病理證實為非小細胞肺癌的50 例患者為研究對象，男性27 例，女性23例，年齡42～83 歲。納入標準：①所有患者均符合《原發性肺癌診療規范（2018年版）》NSCLC 診斷標準［6］；②所有患者手術前均未進行過放療、化療、免疫治療及靶向治療③所有患者知情同意本研究并簽署知情同意書。排除標準：①存在手術禁忌癥者；②除NSCLC 外存在其他惡性腫瘤者；③存在原發性肝腎、功能障礙者；④臨床病例資料不完整或缺乏準確性者。對照組為到本院體檢的健康人群50 例，其中男性28 例，女性22 例，年齡34～78歲，納入標準：①無家族腫瘤史；②無腦心肝腎和消化系統等重要臟器疾病。③體檢者知情同意本研究并簽署知情同意書。排除標準：①存在肺部結節者；②有高血壓、糖尿病史者。肺癌組和對照組在年齡、性別及吸煙史方面比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general data between 2 groups（±s）

表1 兩組一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general data between 2 groups（±s）

資料年齡（歲）性別（男/女）吸煙史(有/無)NSCLC 組（n=50）63.46±10.96 27/23 18/32對照組（n=50）62.36±7.57 28/22 15/35 t/χ2值0.584 0.199 1.489 P 值0.551 0.837 0.236

1.2 主要儀器和試劑

采用miRNA 提取分離試劑盒（批號：R6529）、增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（批號：R6519）、增強型miRNA 熒光定量檢測試劑盒（批號R6510），試劑均購于北京天根生化科技有限公司。使用的主要儀器有熒光定量PCR 儀（ABI，StepOne Plus）、微量分光光度計OneDrop 1000+（松下電器中國有限公司上海分公司）、EcoScreen 冷凝器和Master Screen 簡易冷凝器（德國EricJaeger Company）。德國羅氏602全自動化學發光分析儀。

1.3 方法

1.3.1 標本采集

使用真空管采集各研究對象靜脈全血5 mL，1 000×g 離心10 min，分離血清樣本（≥500 μL），使用無核酸酶（RNase）離心管進行分離，置于-70℃保存備用。NSCLC 患者在入院的第一天行外周血標本采集。對照組則在體檢期間進行外周血標本采集。抽取患者和健康人群術前靜脈血5 mL 于促凝管內，1 000 ×g 離心5 min 后取上清放入無RNase 離心管，保存于-70℃冰箱備用。用EcoScreen 冷凝器或者Master Screen 簡易冷凝器預冷15 min，囑受試者漱口、戴鼻夾，經咬嘴平靜呼吸20 min 后取出收集管，待標本融化后可得到2～4 mL 液體即EBC，隨即放入無RNase 的離心管中，保存于-70℃冰箱備用。

1.3.2 總RNA 的提取

采用北京天根生化科技有限公司生產的組織、血液miRNA 提取分離試劑盒對組織、血液和EBC 樣本進行RNA 的提取。

1.3.3 RNA 含量和純度測定

按照微量分光光度計OneDrop 1000+操作手冊，對提取的miRNAs 進行濃度及純度進行測定。RNA 樣品濃度采用郎伯比爾定律進行計算，采用OD260/OD280比值評價RNA 樣品純度。

1.3.4 參照基因的選擇

本研究選擇在組織細胞中穩定表達、且應用最多的U6 作為NSCLC 患者組織中的參照基因，選cel-miR-39 作為血清和EBC 中目的基因檢測時的參照基因。反應體系：cDNA 2 μL，miRNA 熒光定量檢測試劑10 μL，引物終濃度200 mM，反應體積為20 μL。反應條件：預變性：94℃，2 min，94℃，20 s；64℃，34 s，40 個循環。引物序列見表2。

表2 miRNA34a 和參照基因引物序列Table 2 miRNA34 and reference gene primer sequence

1.3.5 CEA、CYFRA21-1 的檢測

采用化學發光法，按照羅氏602 全自動化學發光分析儀測定試劑盒說明書檢測，CEA 參考范圍：＜5 μg/L。CYFRA211 參考范圍：＜3.5 μg/L。

1.4 統計學處理

采用SPSS Statistics 20.0 軟件進行數據統計處理。計量資料以（±s）表示，計量資料先做正態性檢驗（K-S 檢驗），若數據符合正態分布，組間比較采用t檢驗；若不符合正態分布，采用兩獨立樣本的非參數檢驗（Mann-Whitney 法）。計數資料用n（%）表示，兩組比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織、血清和EBC 中miRNA34a 的表達水平情況

肺癌組織中miRNA34a 的相對表達水平低于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。非小細胞肺癌組血清和EBC 中miRNA34a 的相對表達水平均低于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 組織、血清和EBC 中miRNA34a 的表達水平（±s）Table 3 Expression levels of miRNA34a in tissue，serum and EBC（±s）

表3 組織、血清和EBC 中miRNA34a 的表達水平（±s）Table 3 Expression levels of miRNA34a in tissue，serum and EBC（±s）

樣本類型肺癌組織癌旁組織血清EBC n 健康對照組t 值P 值30 30 50 50 miRNA34a 相對表達水平NSCLC 組0.898±0.957 1.527±1.282 0.795±1.179 0.724±1.157 1.477±1.262 1.355±1.042 5.312 6.496 6.222 0.00 0.00 0.00

2.2 不同病理類型和不同TNM 分期miRNA34a 表達水平

Ⅲ～Ⅳ期NSCLC 患者組織、血清、EBC 中miRNA34a 表達水平均低于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；鱗癌患者EBC 和血清中miRNA34a 相對表達量雖低于腺癌患者，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

2.3 兩組血清miR34a、CEA、CYFRA21-1 水平比較

K-S 檢驗結果顯示，各組的miRNA34a、CEA、CYFRA21-1 的數據均呈偏態分布（P＜0.05）。Mann-Whitney U 檢驗結果顯示，與對照組比較，NSCLC組的血清miRNA34a 表達水平明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），而CEA、CYFRA21-1 水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表5。

表4 不同病理類型和不同TNM 分期miRNA34a 表達水平（±s）Table 4 Expression levels of miRNA34a in different pathological types and TNM stages（±s）

表4 不同病理類型和不同TNM 分期miRNA34a 表達水平（±s）Table 4 Expression levels of miRNA34a in different pathological types and TNM stages（±s）

項目組織血清EBC n 30 50 50 miRNA34a 相對表達水平腺癌（n=24）0.502±0.421 0.969±1.351 0.424±0.554鱗癌（n=6）0.998±1.032 0.865±1.346 0.422±0.497 t 值1.958 1.465 1.462 P 值0.021 0.149 0.150 miRNA34a 相對表達水平Ⅰ～Ⅱ期（n=20）1.247±1.001 1.437±1.525 1.223±1.600Ⅲ～Ⅳ期（n=10）0.201±0.156 0.330±0.487 0.362±0.407 t 值6.324 8.721 10.574 P 值0.000 0.000 0.000

表5 兩組的血清miRNA34a、CEA、CYFRA211 含量比較［M（P25，P75）］Table 5 Content of miRNA34a，CEA and CYFRA21-1 in serum between 2 groups［M（P25，P75）］

2.4 EBC miRNA34a、CYFRA21-1 和CEA 診斷肺癌的敏感性和特異性

EBC miRNA34a、CYFRA21-1 和CEA 三者聯合診斷敏感度和特異度均高于單一診斷值，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表6。

表6 EBC miRNA34a、CYFRA21-1 和CEA 診斷肺癌敏感度、特異度Table 6 Sensitivity and specificity of EBC miRNA34a、CYFRA21-1 and CEA in diagnosis of lung cancer

3 討論

2016年世界衛生組織公布的全球死亡病因統計分析結果，其中氣管癌、支氣管癌和肺癌排名第6［7］。2019年國家癌癥中心報告肺癌位居我國惡性腫瘤發病首位，在城市和農村均占惡性腫瘤死亡第一位［1］。有研究表明對于早期非小細胞肺癌患者中位生存期遠遠長于晚期患者，因此提高早期非小細胞肺癌患者的檢出率至關重要。

miRNA 是一類非編碼小分子RNA，在基因表達中發揮“交通警察”的作用，調控基因表達［2］。Hu［4］等人研究發現有14 種miRNA 在非小細胞肺癌中顯著失調，miRNA 在轉錄后水平負調控基因表達。miRNA34a 是miRNA34 家族的一員，是一類高度保守的miRNA，miRNA34 家族與多種疾病相關。miRNA34a 有多個作用位點，與細胞的生長、腫瘤的轉移都有關系［4-5］。研究表明，miRNA34 在多種腫瘤中，如肺癌、大腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、尿路上皮癌和腎癌中都會有不同程度的表達下降。Kasinski［8］等人在小鼠肺癌模型中發現p53 基因和miRNA34a 基因的相關性，并由此推斷miRNA34a 在肺癌發生中發揮預防劑和靜止劑的作用。miRNA34a 屬于抑癌基因，可通過與癌基因（如c-myc、BCL-2、E2F3、Cyclin D1 及Cyclin E2 等）相結合，促進腫瘤細胞周期停滯于G1 期，抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡。有研究認為，miRNA-34a 不僅是治療NSCLC 的有前途的分子靶點，而且還是一種有用的、新的NSCLC 的預后標志物［9］。本研究結果顯示NSCLC 患者癌組織中miRNA34a 表達與TNM 分期相關，與其它學者的研究結果相一致［10］。單一的腫瘤標志物檢測沒有足夠的靈敏度和特異性，因此，需要敏感、特異的標志物組合來提高腫瘤診斷的敏感性和特異性［11］。本研究對EBC 中miRNA34a、血 清CEA 和CYFRA21-1 對NSCLC 診斷價值進行了分析，聯合檢測可有效提高其診斷的敏感性和特異性。由于本研究樣本量較小，在將其應用于臨床作為篩查試驗之前，還需要進行大規模的多中心臨床研究來驗證其有效性。

總之，隨著對非小細胞肺癌分子生物學研究的深入，基于腫瘤標志物的診斷及預后研究將會有著越來越多的發現，EBC 中的miRNA34a 檢測對NSCLC 的診斷價值值得進一步深入研究。