Xpert MTB/RIF檢測結核分枝桿菌和利福平耐藥的臨床應用

張建平 李紅燕 王大望 劉莎莉 馬艷俠

結核分枝桿菌復合群（M.tuberculosiscomplex，MTB）共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，對大多數抗結核藥物的自然耐受性相近，臨床上結核病的病原菌多為人型結核分枝桿菌和牛分枝桿菌。結核病是一種嚴重危害人民健康的慢性傳染病，我國是結核病高負荷國家，耐藥情況嚴重，在結核病防控工作中結核菌檢查對于發現傳染源、確定診斷和化療方案、考核療效、評價防治效果具有重要意義［1］。結核菌的實驗室檢驗技術涵蓋病原學檢測、免疫學檢測、分子生物學檢測及生物化學檢測。包括痰涂片鏡檢、結核分枝桿菌培養、結核抗體、γ-干擾素釋放試驗/T-Sport，分枝桿菌核酸檢測（TB-NTM-PCR）等［2］。痰涂片鏡檢陽性率低，傳統的羅氏培養法及藥敏試驗檢出結果時間長，不能滿足臨床需要，而肺外標本采用傳統方法診斷較為困難，涂陰培陰的結核患者占73.6%，因此迫切需要能快速、準確檢測結核分枝桿菌及其耐藥性的診斷技術。近年來隨著分子生物學技術的發展，分枝桿菌核酸PCR、實時熒光RNA 恒溫擴增檢測（SAT）、Xpert 結核分枝桿菌/利福平快速分子鑒定（Mycobaeterium tuberculosis/Rifampicin，MTB/RIF）、線性探針、基因芯片等新的檢驗方法也不斷應用于臨床［3］。本研究對肺結核病患者的痰標本分別采用直接涂片抗酸染色（Z-N 法）、結核桿菌MGIT 液體培養、Xpert MTB/RIF方法進行檢測，現分析報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年1月至2018年9月在本院傳染病院住院的確診肺結核病患者116 例，納入標準：參照WS 288-2017 肺結核診斷標準［4］，依據臨床表現、胸部影像學及實驗室檢查。其中結核桿菌MGIT液體培養陽性72 例，男51 例，女21 例，年齡16～90歲，平均年齡50.6 歲，男女性別比2.43∶1。培養陰性44 例，男31 例，女13 例，年齡21～88 歲，平均年齡49.5 歲，男女性別比2.38∶1。排除標準：影像學及實驗室檢查均排除非結核分枝桿菌肺病及其它肺部疾病。實驗采用研究對象的痰標本，研究經過醫院倫理委員會同意，免于簽署患者知情同意書。

1.2 標本采集

收集3 份痰標本（當日即時痰、夜間痰和次日晨痰）。患者用清水漱口后，深吸氣2～3 次，每次用力呼出，從肺部深處咳出第2、3 口痰液收集于樣本容器，擰緊盒蓋送檢。對當日不能檢測的痰標本置于4℃冰箱保存，不超過12 h，要求標本量一般3～5 mL，標本采集前均未使用抗結核藥物治療［4］。

1.3 儀器與試劑

采用全自動醫用PCR 分析系統（美國Cepheid公司，型號：GeneXpert）、全自動分支桿菌培養監測儀（美國BD 公司，型號：BACTEC MGITTM320）、生物顯微鏡（德國Leica 公司，型號：MD1000）。Xpert MTB/RIF 檢測試劑盒（美國Cepheid 公司）、BBLTMMGITTM培養管（美國BD 公司）、分枝桿菌聯合藥敏試劑盒（美國BD 公司）、抗酸染色試劑盒（珠海貝索公司）。

1.4 檢測方法

1.4.1 直接涂片抗酸染色

對3 份痰標本采用萋尼染色法（Z-N 法），參照WS 288-2017 肺結核診斷、《中國結核病防治規劃。痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》進行標準化操作及質量控制，涂片陽性結果定義為至少兩份標本判斷為陽性［4-5］。

1.4.2 MGIT 液體培養

對3 份混合痰標本用2% N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH 進行處理，將處理后的標本接種于含營養添加劑及抑制劑的MGIT 液體培養管，放入BACTEC MGITTM320 儀器自動檢測，通過分析熒光強度判斷是否有結核MTB 生長，一般快速7～14 d 培養陽性，培養周期設定42 d。

1.4.3 MGIT 聯合藥敏試驗

使用MGIT 陽性1 天的懸浮培養液，按照藥敏試劑盒接種程序操作，4～13 d 內通過分離菌株在含藥培養管和生長對照管的對比確定藥物敏感性結果。

1.4.4 Xpert MTB/RIF 技術

取1 mL 混合痰標本加入2 mL 樣本處理液，按照操作規程將處理后的樣本加入檢測盒，置于GeneXpert 檢測模塊自動檢測。該技術采用巢式實時熒光定量PCR，針對結核分枝桿菌rpoB基因81 bp 利福平耐藥核心區（rifampin resistance determining region，RRDR）設計引物、探針，檢測其是否突變。

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0 統計分析，計數資料以n（%）表示，組間比較采用Pearson 卡方檢驗，采用McNemar 檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 種檢測方法陽性率比較

3 種檢測方法陽性率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3 種檢測方法陽性率比較［n（%）］Table 1 Comparison of positive rate of 3 methods［n（%）］

2.2 MGIT 液體培養與Xpert MTB 結果比較

MGIT 液體培養與Xpert MTB 結果比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。以臨床確診為診斷標準，Xpert 法靈敏度90.3%，特異度77.3%，陽性預測值86.7%，陰性預測值82.9%，Youden 指數0.676，總符合率85.3%。見表2。

表2 MGIT 液體培養與Xpert MTB 結果比較［n（%）］Table 2 MGIT liquid culture and XPERT MTB results comparison［n（%）］

2.3 Xpert MTB 與Z-N 法結果比較

Xpert MTB 與Z-N 法結果比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 Xpert MTB 與Z-N 法結果比較［n（%）］Table 3 Xpert MTB and Z-N results comparison［n（%）］

2.4 Xpert MTB/RIF rpoB 基因檢測結果

75 例Xpert MTB/RIFrpoB基因檢測結果分析，66 例Xpert MTB/RIFrpoB基因未檢出突變，即未檢測到RIF 耐藥，與MGIT 聯合藥敏試驗利福平敏感結果一致，9 例Xpert MTB/RIFrpoB基因突變被檢出，為RIF 耐藥，而藥敏試驗為利福平敏感，總符合率88.0%（66/75）。見表4。

表4 Xpert 利福平rpoB 基因檢測結果［n（%）］Table 4 The results of Xpert rpoB gene［n（%）］

3 討論

結核桿菌耐藥表型及耐藥基因型關系的確立，為基于利福平耐藥基因rpoB突變為靶點的診斷奠定了基礎［6］。Xpert MTB/RIF 以5 條引物探針選擇性覆蓋結核分枝桿菌特有的序列rpoB基因81 bp 上RRDR，第6 條探針用做內部質量控制，以檢測標本是否含有結核分枝桿菌復合群（MTB）以及利福平是否耐藥［7］。

WHO 推薦Xpert MTB/RIF 對成人疑似多重耐藥結核或HIV 相關肺結核初篩診斷，Xpert MTB/RIF 檢測結核分枝桿菌靈敏度高［8］。據報道，抗酸染色法通常需5 000 CFU/mL 才能得到陽性結果，而Xpert MTB/RIF 方法的檢測限（LoD）為131 CFU/mL，尤其在MTB DNA 低拷貝時，抗酸染色法往往是陰性結果。本研究顯示，痰直接涂片抗酸染色法的陽性率遠遠低于Xpert MTB 與MGIT液體培養陽性率，而Xpert MTB 與MGIT 液體培養陽性率接近。直接痰涂片陽性率低，容易漏檢，也和未采用濃縮集菌法涂片、熒光染色鏡檢以及與工作人員的涂片質量和閱片技能有一定關系［9］。

國外有報道，Xpert MTB/RIF 試驗在痰涂片陽性的標本中，其敏感性接近100%，本文的研究結果與其一致［10］。文獻報道，傳統羅氏培養陽性率為44.5%，培養時間約6～8 周，MGIT 液體培養陽性率為62.1%，7～14 天培養陽性，較羅氏培養陽性率提高，且培養時間縮短，但對生物安全級別要求高，在基層難以開展［11］。而Xpert MTB/RIF方法整個流程僅需2 h，手工只需處理樣本即上機自動檢測。本文研究結果表明Xpert MTB/RIF檢測具有同液體培養及藥敏試驗接近的臨床應用價值，提示可以用Xpert MTB/RIF 對疑似耐藥結核進行初篩［12］。

除了痰標本外，Xpert MTB/RIF 還可以檢測灌洗液、胸腹水、引流液、腦脊液標本，據研究報道，陽性率依次為灌洗液65.9%、痰樣本53.9%、胸水16.4%，特異性均較高［13］。Xpert MTB/RIF 檢出rpoB 陽性基因型耐藥高于藥敏試驗表型耐藥結果，大多數原因是標本中存在異質性利福平耐藥，與某些基因位點突變的低水平耐藥相關，也可能存在Xpert MTB/RIF 檢測的假耐藥，可能與沉默子突變或Xpert MTB/RIF 檢測系統判讀錯誤有關，對不一致菌株應進行rpoB 耐藥基因核心區間測序［14］。另外，Xpert MTB/RIF 系統不能區分是否活性結核分枝桿菌，不能被用于監測治療或復發［15］。綜上，Xpert MTB/RIF 是一種結核病快速診斷的新方法，具有快速、簡便、準確、對生物安全要求不高等特點，可以在基層開展，能同時檢測出結核分枝桿菌及是否對利福平耐藥，對肺結核及肺外結核病的早期診斷具有重要意義，是痰涂片鏡檢及培養檢查方法的有力補充。