腸道菌群紊亂在大鼠非酒精性脂肪肝中的作用機制

耿妍 魯曉嵐 耿燕 史海濤

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確肝損傷因素外所致的，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變為主要特征的臨床病理綜合征［1］。隨著“全球肥胖”的流行，NAFLD 在中國及歐美發達國家的患病率逐年升高，該病目前已被公認為是成人及兒童慢性肝臟疾病的首要病因［2］。NAFLD 作為一種復雜的疾病，病理生理機制尚未完全闡明，其發生發展的主要危險因素包括肥胖、胰島素抵抗、2 型糖尿病、高脂血癥等［3］。因此，探究單純性肥胖引起NAFLD 的發病機制，對于了解從單純性肥胖（Simple Obesity，SO）進展為NAFLD 這一過程至關重要。近年來，多項研究發現腸道菌群作為一個新的環境因素在肥胖和NAFLD 的發生中發揮重要作用［4-5］。目前腸道菌群在肥胖轉化為NAFLD 的作用及機制研究較少，本研究將探討腸道菌群在肥胖及NAFLD的作用，以期為肥胖及NAFLD 的防治提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD 雄性大鼠［動物合格證號：skxk（shaan）2018-001］購自西安交通大學醫學院動物實驗中心。內毒素檢測試劑盒購自北京金山川科技發展有限公司。糞便總DNA 提取試劑盒購自北京艾德萊試劑有限公司。實時定量PCR 反應試劑盒購自日本TaKaRa 公司。ELISA 試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司。全自動生化分析儀購自日本OLYMPUS 公司。

1.2 實驗動物

8 周齡雄性SD 大鼠30 只（SPF 級），平均體重160 g 左右，分籠飼養于西安交通大學醫學院動物實驗中心（動物實驗條件符合二級標準）。高脂飼料配方：10%豬油、2%膽固醇、5%蔗糖、0.5%豬膽鹽、82.5%基礎飼料；普通飼料購自西安交通大學醫學院動物實驗中心。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

將30 只大鼠隨機分為對照組（NC 組）（普通飼料，n=6）、模型組（高脂飼料，n=24）。分別給予普通飼料及高脂飼料喂養8 周。于8 周末處死所有大鼠，行肝臟蘇木精伊紅（Hematoxylin and Eosin，HE）染色，光鏡下觀察篩選模型組中發生脂肪變的為NAFLD 組（n=12），未發生脂肪變的為SO 組（n=12）。

1.3.2 血清生化指標檢測

全自動生化分析儀檢測血清：膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、谷丙轉氨酶（Alanine transaminase，ALT）、谷草轉氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）。

1.3.3 動態比濁法測定血清內毒素

按照內毒素檢測試劑盒的說明書操作。

1.3.4 肝臟組織及回腸粘膜HE 染色

分別取各組大鼠肝臟及回腸組織（距回盲瓣7～17 cm），置于4%的多聚甲醛溶液中，常規制成石蠟切片，行HE 染色。

1.3.5 腸道糞便中乳酸桿菌屬、大腸桿菌屬、雙歧桿菌屬的測定

嚴格按照北京艾德萊試劑糞便總DNA 提取試劑盒及日本TaKaRa 公司熒光實時PCR 反應試劑盒操作。以DNA 為模板，PCR 擴增大腸桿菌屬，乳酸桿菌屬，雙歧桿菌屬，標準品為內參。引物見表1［6］。

表1 相關引物信息Table 1 Related primer information

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，差異有統計學意義者兩組間比較采用LDL-t檢驗。糞便細菌定量結果數據以logx±s表示。采用Pearson相關分析和Spearman 秩相關分析自變量和因變量之間的相關性。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀況、體重及飲食變化

實驗過程中，各組大鼠均無死亡。喂養至第8周時，NC 組大鼠皮毛光澤，反應靈敏。SO 組及NAFLD 組大鼠皮毛暗淡無光澤，活動減少，精神萎靡，進食量較多。喂養至第4、8 周時模型組大鼠體重明顯高于NC 組大鼠，差異具有統計學意義（P＜0.05），而SO 組與NAFLD 組體重比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 肝臟病理變化

光鏡下可見NC 組大鼠肝細胞呈條索狀排列，圍繞中央靜脈呈放射狀，核圓、大、居中。SO 組大鼠肝細胞排列整齊，無脂滴及炎癥細胞浸潤。NAFLD 組大鼠肝細胞排列整齊，可見散在小泡性脂滴浸潤，無明顯炎癥細胞及壞死。見圖1。

表2 各組大鼠體重變化（±s，g）Table 2 Weight change in each group（±s，g）

表2 各組大鼠體重變化（±s，g）Table 2 Weight change in each group（±s，g）

注：與NC 組比較，aP＜0.05。

分組NC 組SO 組NAFLD 組F 值P 值0 w 體重241.75±11.56 246.90±12.30 245.51±13.54 44.352 0.912 2 w 體重345.25±12.84 387.95±22.32 397.83±16.92 46.368 0.819 4 w 體重392.25±16.93 454.95±24.84a 463.21±11.85a 48.305 0.033 8 w 體重451.75±13.25 508.77±26.29a 514.75±16.23a 50.023 0.025

圖1 各組大鼠肝臟病理改變（HE，×400）Figure 1 Pathological changes of liver of rats in each group（HE，×400）

2.3 各組大鼠血清轉氨酶、內毒素、血脂比較

SO 組及NAFLD 組大鼠血清ET、TG 水平顯著高于NC 組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。SO組TC 水平顯著高于NC 組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。NAFLD 組ET 水平顯著高于SO 組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。3 組間ALT、AST 水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。NAFLD 組與余兩組TC 水平比較差異無統計學意義（P＞0.05），NAFLD 與SO 組TG 水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠腸道菌群的變化

模型組腸道糞便大腸桿菌屬數量顯著高于NC 組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。NAFLD 組大腸桿菌屬數量顯著高于SO 組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。模型組雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬數量顯著低于NC 組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。NAFLD 組雙歧桿菌屬數量顯著低于SO組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。SO 組與NAFLD 組乳酸桿菌數量相比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

2.5 腸道病理改變

光鏡下可見NC 組小腸粘膜表面微絨毛排列整齊，結構清晰。SO 組小腸上皮細胞腫脹，細胞游離面微絨毛短小，排列紊亂，黏膜層可見少許炎性細胞浸潤，伴灶性糜爛。NAFLD 組小腸粘膜上皮細胞腫脹，結構明顯紊亂，細胞游離面微絨毛短小，黏膜層可見大量炎性細胞浸潤，伴灶性糜爛。見圖2。

表3 三組大鼠血清轉氨酶、內毒素、血脂的比較（±s）Table 3 Comparison of serum transaminase and endotoxin of 3 group（±s）

表3 三組大鼠血清轉氨酶、內毒素、血脂的比較（±s）Table 3 Comparison of serum transaminase and endotoxin of 3 group（±s）

注：與NC 組比較，aP＜0.05，與SO 組比較，bP＜0.05。

分組NC 組SO 組NAFLD F 值P 值ALT（IU/L）48.50±12.39 48.33±13.45 50.58±12.63 1.012 1.351 AST（IU/L）146.67±16.77 154.67±12.37 156.75±13.19 0.534 1.026 ET（pg/mL）4.21±1.80 10.95±4.79a 15.43±4.64ab 26.321 0.001 TC 1.44±0.45 2.07±0.48a 1.85±0.44 0.931 0.005 TG 1.14±0.54 2.04±0.33a 2.34±0.49a 1.021 0.002

表4 各組大鼠腸道菌群結果比較（±s）Table 4 The results of intestinal flora in rats were compared（±s）

表4 各組大鼠腸道菌群結果比較（±s）Table 4 The results of intestinal flora in rats were compared（±s）

注：與NC 組比較，aP＜0.05，與SO 組比較，bP＜0.05。

分組NC 組SO 組NAFLD 組F 值P 值大腸桿菌屬8.41±0.96 8.99±0.49a 9.54±0.69ab 15.362 0.000雙歧桿菌屬9.23±0.65 8.65±0.33a 8.36±0.57ab 19.821 0.000乳酸桿菌屬8.38±0.72 7.76±0.47a 7.33±0.49a 18.365 0.021

圖2 各組大鼠小腸粘膜病理改變（HE，×400）Figure 2 Pathological changes of small intestinal mucosa of rats in each group（HE，×400）

2.6 腸道菌群與內毒素、轉氨酶的相關性分析

Pearson 相關分析及Spearman 秩相關分析表明，大腸桿菌與ET、肝臟脂肪變程度均呈正相關（P＜0.05），乳酸桿菌、雙歧桿菌與ET、肝臟脂肪變均呈負相關（P＜0.05）。見表5。

3 討論

肥胖是導致NAFLD 的重要危險因素，有研究表明在重度肥胖人群中NAFLD 的發病率可達90%［7］。從肥胖到NAFLD 的發生發展有多種機制參與，其中腸道菌群的構成紊亂可能是重要的組成部分。本研究通過高脂飲食的飼養誘導大鼠肥胖模型，觀察到高脂飲食可以誘發大鼠腸道菌群紊亂以及NAFLD 的出現。

陳杏云等［8］通過高脂飼料喂養小鼠8 周后，發現小鼠腸道菌群結構發生了明顯變化，這與本實驗研究結果一致。分析高脂飲食對于腸道菌群構成影響的機制，已有的研究結果表明，高脂飼料可以使腸道中作為菌群養料來源的碳水化合物的生成減少，同時高脂飲食代謝的部分產物可以破壞腸道菌群所在的微環境，從而影響腸道菌群的組成平衡，導致機體腸道菌群的紊亂［9］。

腸道菌群可以通過多種機制影響肥胖。首先，腸道菌群可以影響機體的能量平衡。B?ckhed等［10］的研究發現肥胖小鼠的腸道菌群酵解碳水化合物的能力增強，因此為宿主提供的能量增多，促進肥胖。其次，腸道菌群失調可破壞腸道上皮屏障，增加腸道的通透性，使得血清內毒素含量增多，這種腸源性內毒素水平的升高可以導致慢性炎癥的形成，進而導致肥胖［11］。

腸道菌群紊亂既可以通過促進肥胖間接地影響NAFLD，也可以通過多種通路直接促進NAFLD。例如，針對NAFLD 的研究表明腸道菌群通過改變腸道對膽堿和膽汁酸的代謝，產生丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸及禁食誘導脂肪因子等，從而影響NAFLD 的發病［12］。另一方面，前述的血清內毒素可經由門靜脈進入肝臟，誘導肝細胞產生腫瘤壞死因子、白細胞介素-1、白細胞介素-6 等炎性細胞因子，促進NAFLD 的發病［13-14］。本研究發現NC 組到SO 組，再到NAFLD 組，大腸桿菌屬計數顯著增加，而優勢菌顯著減少，腸道粘膜結構由輕到重均有破壞，腸源性內毒素水平逐漸增高，這與之前研究是一致的［15］。行相關性檢驗發現，大鼠腸道菌群失調與內毒素及脂肪肝病變程度呈正相關。研究結果提示腸道菌群紊亂在脂肪蓄積及從SO 向NAFLD 進展過程中均發揮重要作用。

從治療的角度來說，有研究顯示雙歧桿菌可改善腸道屏障功能并降低血清內毒素水平，從而減緩NAFLD 的進展［16］。另外，對肥胖患者采取飲食干預能夠使產生內毒素的腸道菌種類比例明顯下降［17］。

表5 腸道菌群與內毒素、肝脂肪變程度的相關性分析Table 5 Correlation analysis of intestinal flora with endotoxin and liver fat change

綜上所述，腸道菌群可通過多種途徑和機制影響NAFLD 的發病。通過優化腸道菌群構成，針對NAFLD 的靶向治療在動物模型中獲得一定療效，但迄今為止相關的臨床研究不足。隨著現代生物技術的進步，調節腸道菌群或可成為治療NAFLD的新方式。