基于TCGA數據集分析CDCA5在肺腺癌中的臨床意義與分子機制

王萍 黃奔 范維 柳家翠 程慶元 段怡萍 陳梁玥 馬甜甜 喻明霞★

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，研究表明，超過半數的肺癌患者在中晚期才被確診［1］。肺癌主要包括兩種組織性類型：小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中肺腺癌是非小細胞肺癌中診斷最多的組織學亞型［2］。盡管在研究發病機制和治療方法方面取得了一定的進展，肺腺癌仍然是最具侵襲性和最迅速致命的類型，其5年生存率低于20%［3］。細胞分裂周期相關5（cell division cycle associated 5，CDCA5）是在細胞分裂周期中姐妹染色單體結合和分離所必需的主要調節因子［4］。CDCA5保證了減數分裂細胞和有絲分裂細胞中染色體的精確分離，在DNA 修復中起著重要的作用［5］。研究發現，CDCA5與腫瘤的發生發展密切相關。CDCA5被證實在乳腺癌、胃癌、結直腸癌等癌癥中異常表達，且與癌癥患者的預后相關［6-8］。然而，關于CDCA5在肺腺癌中的表達、臨床意義、預后以及分子機制目前尚無研究報道。因此，本研究通過數據挖掘癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫，分析CDCA5在肺腺癌中的表達，探究CDCA5在肺腺癌中的表達與患者臨床病理特征的聯系，結合患者的生存資料分析其預后價值，探索其在肺腺癌中的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 數據資料的下載與處理

在TCGA 數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）上下載535 例肺腺癌樣本和59 例正常肺組織樣本RNA 測序數據（HTSeq-FPKM，level 3）。使用R 3.6.1 軟件將基因表達數據歸一化處理，再進行log2轉化用于后續分析。利用R 3.6.1 軟件提取肺腺癌樣本和正常肺組織樣本中CDCA5mRNA 的表達量用于分析比較表達水平差異。此外，在TCGA數據庫中下載肺腺癌患者的臨床資料，包括患者的年齡、性別、生存時間、生存狀態、T 分期、N 分期、M 分期、stage 分期。刪除生存時間缺失和上述任何一項臨床特征不明確的患者數據。

1.2 CDCA5 表達與患者臨床特征和預后的相關性分析

根據CDCA5在肺腺癌患者中表達水平的中位值，將肺腺癌患者劃分為高表達組和低表達組。使用IBM SPSS Statistics 25.0 統計軟件分析CDCA5表達與患者的年齡、性別、T 分期、N 分期、M 分期、stage 分期的聯系。使用GEPIA 在線數據庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）和OncoLnc 在線數據庫（http：//www.oncolnc.org/）分析CDCA5與患者總體生存率（overall survival，OS）的關系，使用Kaplan Meier-plotter 在線數據庫（https：//kmplot.com/analysis/）分析CDCA5與患者總體生存率（overall survival，OS）和進展后生存率（post progression survival，PPS）的關系。根據TCGA-LUAD 數據集中肺腺癌患者的生存數據，結合CDCA5的表達量，使用單因素和多因素cox 回歸分析CDCA5在肺腺癌患者中的預后價值。

1.3 基因富集分析

使用GSEA 4.0.2 軟件進行基因富集分析。以MsigDB（Molecular Signature Database）數據庫中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 數據集作為功能基因集。采用缺省加權富集統計的方法，隨機組合次數設1 000 次。以P＜0.05 和錯誤發現率（false discovery rate，FDR）小于0.05 的基因集作為顯著富集的基因集。

1.4 統計學分析

使用Mann-Whitney U 檢驗分析CDCA5在肺腺癌樣本和肺正常組織樣本中的表達差異；使用卡方檢驗分析CDCA5表達與患者臨床特征的相關性；生存分析使用log rank 檢驗；cox 比例風險回歸模型用于評價CDCA5的預后意義。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CDCA5 在肺腺癌組織中表達顯著上調

在TCGA-LUAD 數據集中，肺腺癌組織的CDCA5表達水平顯著高于正常組織，差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖1A）。在57 對配對的肺腺癌組織和癌旁組織中分析發現，CDCA5在肺腺癌組織中顯著上調，差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖1B）。在GEPIA 數據庫中，共有483 例肺腺癌組織樣本、347 例正常肺組織樣本，結果也顯示CDCA5在肺腺癌組織中顯著上調表達（P＜0.05）。圖1C。

圖1 CDCA5 在肺腺癌組織和正常肺組織樣本中的表達差異分析Figure 1 Differential analysis of CDCA5 expression in lung adenocarcinoma and normal lung tissue samples

2.2 CDCA5 與肺腺癌患者臨床病理特征的聯系

相關性分析顯示CDCA5在肺腺癌患者中的表達與Stage 分期（P=0.003）和淋巴結浸潤（P=0.016）有關。見表1。

表1 CDCA5 表達與患者臨床特征的相關性分析［n（%）］Table 1 Correlation analysis of clinical characteristics between CDCA5 expression and patients［n（%）］

2.3 CDCA5 高表達提示患者預后不良

在GEPIA 數據庫中，CDCA5的表達水平與患者的總體生存率相關，高表達提示預后不良（P=0.006）（圖2A）；OncoLnc 數據庫分析結果顯示CDCA5的表達也與患者的總體生存率相關（P=0.003）（圖2B）；Kaplan Meier-plotter 數據庫分析結果表明高表達的CDCA5 與肺腺癌患者的總體生存率（HR=2.04，95%CI：1.72～2.42，P＜0.05）（圖2C）和進展后生存率（HR=1.67，95%CI：1.08～2.58，P=0.020）正相關（圖2D）。

圖2 CDCA5 與肺腺癌患者預后的相關性分析Figure 2 Prognosis analysis between CDCA5 expression and lung adenocarcinoma

在TCGA-LUAD 數據集中，單因素cox 回歸分析結果顯示，Stage 分期、T 分期、N 分期和CDCA5均可以作為肺腺癌潛在的預后因素（P＜0.001）。而多因素cox 回歸分析結果提示，只有Stage 分期（HR=1.90，95%CI：1.18～3.04，P=0.010）和CDCA5表達（HR=1.28，95%CI：1.06～1.54，P=0.010）可以作為肺腺癌的獨立預后因素。見表2。

表2 單因素和多因素cox 回歸分析Table 2 Univariate and multivariate cox regression analysis

2.4 GESA 富集分析結果

GSEA 分析結果顯示，CDCA5主要參與了22 條信號途徑（P＜0.05，FDR＜0.05）。其中包括了細胞周期、DNA 復制、錯配修復、同源重復、RNA 降解和P53 信號通路等和致癌相關的途徑。見表3、圖4。

表3 GSEA 富集分析結果Table 3 Results of GSEA enrichment analysis

圖4 CDCA5 基因高表達樣本相關富集基因集Figure 4 High expression of CDCA5 gene in samples correlated with enrichment of gene sets

3 討論

細胞分裂周期相關（cell division cycle-associated，CDCA）蛋白家族由8 個成員組成（CDCA1-8）。其中CDCA5基因位于染色體11q13.1，它在間期細胞的細胞核中表達，在有絲分裂中從染色質中分散，并與內聚蛋白復合物相互作用［4，9-11］。在培養的細胞中，敲除CDCA5會導致有絲分裂停滯和姐妹染色單體粘聚失?。?2］。CDCA5是姐妹染色單體粘聚和分離的主要調節因子，主要作用是穩定姐妹染色單體，調節有絲分裂，維持基因組的完整性和穩定性［4］。研究表明，細胞分裂過程中的障礙會導致癌癥的發生［13-14］，因此CDCA5在腫瘤的發生發展中的作用也受到了研究者的關注［15-17］。然而，目前對CDCA5在肺腺癌中的研究鮮有報道。

Phan 等研究者［6］通過利用生物信息學分析發現，CDCA5在乳腺癌組織中異常表達，高表達CDCA5的患者3年生存率低于50%。在肝細胞癌組織中，CDCA5mRNA 和蛋白表達也明顯均高于正常組織，且與患者的組織學分級、腫瘤大小和TNM 分期等顯著相關［15-18］；Kaplan-Meier 生存分析顯示，CDCA5 表達升高的患者的總體生存率較短［19］。機制分析表明，CDCA5可以通過AKT 通路促進肝細胞癌細胞增殖，從而促進了腫瘤發生［20］。在胃癌中，CDCA5可以通過影響Cyclin E1的表達而影響細胞周期，在胃癌的進展中起到關鍵作用［7］。CDCA5還可以通過激活ERK 信號通路促進結直腸癌進展［8］。高表達的CDCA5也與上尿路和膀胱尿路上皮癌患者的疾病特異性生存（disease free survival，DSS）和無轉移生存（metastatic free survival，MeFS）顯著相關［5］。這些研究結果都表明了CDCA5在腫瘤中扮演了重要的角色，可作為人類腫瘤的新型分子標志物。

本研究利用GESA 分析發現，CDCA5在肺腺癌中參與多種分子途徑，因此沉默CDCA5的表達，阻斷CDCA5介導的致癌途徑或許也可成為肺腺癌的治療策略。

綜上所述，CDCA5在肺腺癌中異常表達上調，并與肺腺癌患者的惡性進展相關，高表達的CDCA5提示患者預后不良。CDCA5可以作為肺腺癌的獨立預后因素，并且有望成為肺腺癌治療的分子策略。