二代測序技術在急性髓系白血病患者預后中的應用價值

牛曉娜 葛菲 郭宏崗 陳香麗 郭建民

急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia，AML）是成人中最常見急性白血病類型，以中老年人居多。AML 發病過程中，每個群體不同時間段里經歷不同的遺傳學改變，致使染色體核型、基因突變類型及臨床特征有很大異質性，而這些異質性是預后差異的基礎［1-2］。現階段，臨床已將AML患者分子生物學層面納入危險度分層系統，分為預后良好、預后中等、預后不良。隨著高通量基因測序技術的發展，國內外學者研究了AML 相關基因突變及其在疾病發生中的機制，并已明確了一些特殊類型的突變或融合基因用于指導治療方案的制定［3-4］。本研究嘗試分析二代測序（Next-generation sequencing，NGS）技術下AML 患者基因突變情況，并探討具體基因突變類型對預后及生存狀況的影響。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2016年1月至2018年6月確診的298例AML 患者作為研究對象，男186 例，女112 例，年齡≥45 歲120 例，年齡＜45 歲178 例。納入標準：①均符合AML 診斷標準［5］；②經骨髓和外周血細胞形態學檢查、流式免疫分型、骨髓活檢、染色體核型分析等檢查確診；③患者知情同意。排除標準：治療相關性白血病、MDS 或MPN 轉化白血病等繼發白血病患者。研究經本院醫學倫理委員會審批同意。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

抽取患者骨髓液4～6 mL，EDTA 抗凝，分離并收集骨髓單個核細胞，柱式抽提試劑盒提取DNA，采用AML/MDS-NGS 芯片（上海源奇生物醫藥科技有限公司）進行基因突變檢測，涵蓋ASXL1、NPM1、

FLT3、KIT、DNMT3A、CEBPA、IDH、EZH2、TET2、RUNX1、TP53、SF3B1、PHF6、SRSF2、RAS、U2AF1、JAK等基因的熱點突變區域，測序深度3 000×。

1.2.2 治療方法

年齡≤60 歲者，予IA3+7 方案（去甲氧柔紅霉素8～12 mg/m2×3 d+阿糖胞苷100 mg/m2×7 d）誘導化療；年齡＞60 歲者，予DA3+7 方案或CAG（阿克拉霉素10～14 mg/m2×4 d+阿糖胞苷10 mg/m2，2 次/d×14 d+集落刺激因子300 μg/d）等預激方案誘導化療。完全緩解（CR）后進入鞏固階段，予中、大劑量阿糖胞苷單藥至少4 個療程。

1.3 觀察指標

①AML 基因突變頻率及分布情況。②根據《成人急性髓系白血病（非急性早幼粒細胞白血病）中國診療指南（2017年版）》［6］中預后危險度分級分為預后良好組、預后中等組、預后不良組，對比3 組臨床資料、基因突變頻率、主要基因突變類型。③基因突變與預后的關系。④伴或不伴基因突變對無病生存期、總生存期的影響。⑤不同基因突變類型對中位無病生存期的影響。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計軟件進行數據分析；計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；符合正態分布的計量資料采用（±s）表示，組間比較用獨立樣本t檢驗。預后影響因素分析應用Logistic 回歸分析；Kaplan-Meier 生存曲線分析伴基因突變、NPM1、FLT3-ITD、DNMT3A、TET2 突變陽性與患者生存期的關系，采用Log-Rank 檢驗；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AML 基因突變頻率及分布情況

298 例AML 患者中位突變數目為兩個（0～6），其中256 例可檢測到基因突變，占85.91%；≥3 種基因突變71 例，占23.83%。突變頻率最高的前5 個基因分別為NPM1、FLT3-ITD、CEBPA、DNMT3A、TET2。見圖1。

圖1 AML 基因突變頻率及分布情況Figure 1 Frequency and distribution of AML gene mutations

2.2 3 組臨床資料、基因突變頻率

3 組初診骨髓原始細胞、附加染色體異常、伴基因突變、NPM1、FLT3-ITD、CEBPA、DNMT3A、TET2突變陽性比例比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 基因突變與預后不良的關系

將初診骨髓原始細胞、附加染色體異常等其他因素控制后，伴基因突變、FLT3-ITD、DNMT3A、TET2突變陽性仍與預后不良顯著相關（P＜0.05）；CEBPA突變陽性與預后不良無關。見表2。

表2 基因突變與預后不良的關系Table 2 Relationship between gene mutation and poor prognosis

2.4 基因突變對無病生存期、總生存期的影響

隨訪兩年，脫落8 例。伴基因突變的AML 患者中位無病生存期11.87 個月短于不伴基因突變的AML 患者15.07 個月（χ2=5.168，P=0.023）。見圖2。

圖2 基因突變對中位無病生存期的影響Figure 2 The effect of gene mutations on median diseasefree survival

2.5 不同基因突變類型對中位無病生存期的影響

Kaplan-Meier 曲線分析，NPM1突變陽性的AML 患者中位生存期14.71 個月長于陰性患者11.63 個月，FLT3-ITD、DNMT3A、TET2突變陽性的AML 患者中位無病生存期11.06 個月、11.24 個月、11.32 個月短于FLT3-ITD、DNMT3A、TET2突變陰性的AML 患者15.73 個月、14.86 個月、14.19 個月，差異有統計學意義（χ2=5.223、6.277、5.341、7.552，P=0.022、0.012、0.021、0.006）。見圖3。

圖3 不同基因突變類型對中位無病生存期的影響Figure 3 The effect of different gene mutation types on median disease-free survival

3 討論

NGS 技術在大型綜合基因組分析的應用極大提高了臨床對AML 發生、發展機制的認識，重現性基因突變的不斷發現打開了相關機制研究的思路。2016年WHO 對AML 分類再次做了更新［7］，NPM1、CEBPA、RUNX1等突變均已被納入AML 診斷參考，為AML 做進一步的精細分層。

現階段，采用NGS 技術探索AML 患者基因突變譜的大樣本數據有限，美國癌癥基因譜研究網絡報道病例數為200 例，歐洲多中心數據共納入1 540例患者，國內多個研究中心，包括蘇州大學附屬第一醫院、上海7 家綜合性醫院等［8-11］也發表了各自數據。雖然各中心檢測的目標基因略有不同，但都基本覆蓋了NPM1、FLT3、IDH、DNMT3A、TET2、TP53、RUNX1、RAS、WT1、CEBPA等AML 常見基因。本研究與美國多中心數據22%相近，高于上海7 家綜合性醫院報道的數據13%。從基因突變結果看，AML 伴NPM1突變患者占11.62%，與國內其他中心數據相似，但明顯低于美國人群（27%）與歐洲人群（28%）。產生差異的原因尚不明確，是否與患者種族、生活方式、生活環境等有關還期待更多數據支持。伴DNMT3A突變的患者占10.15%，蘇醫一附院6%，上海7 家綜合性醫院9%，均低于美國數據（26%）。研究證實，DNMT3A突變與診斷時的高白細胞、老年和不良預后有關［12］。上海7 家綜合性醫院對入組患者進行年齡分層后發現，50 歲以上患者DNMT3A突變頻率是50 歲以下患者的3倍以上。蘇醫一附院患者中位年齡42 歲，而美國患者中位年齡55 歲。故推測各中心患者中位年齡可能是數據差異的原因之一。

NPMl突變在成人AML 中的中位年齡偏高，血小板、白細胞數目較高，且與CD34 和CDll7 低表達相關［13］。研究顯示，NPMl突變預示化療后易達到CR［14］。本研究發現，NPM1突變陽性者預后好。FLT3-ITD突變的AML 患者外周血骨髓原始細胞比例、白細胞數較高，CR 率和總生存率偏都偏低，復發率偏高［15］。本研究發現，FLT3-ITD基因突變是預后不良因素。DNMT3A基因貫穿造血干細胞自我更新、分化和抑癌基因失活、原癌基因激活的過程，該基因突變在AML 發病機制中起著舉足輕重的作用。Meta 分析顯示，DNMT3A基因突變是AML 患者第一療程緩解率和總體生存率的危險因素［16］。本研究結果提示，DNMT3A突變陽性提示預后不良。目前，TET2基因突變在評估疾病預后方面尚無統一結論。本研究數據顯示，TET2突變陽性者生存期短，與李佳佳等［17］研究一致，但TET2基因突變易發生在年齡偏大的患者中，而年齡不同治療方案不一，故預后可能受到年齡及治療方案影響，可能導致數據偏移，仍需擴大樣本數排除影響因素進行進一步分析。

綜上可知，不同預后AML 患者基因突變頻率存在差異，伴基因突變及FLT3-ITD、DNMT3A、TET2突變陽性者生存期短，預后差，而NPM1突變陽性者與之相反。