GeneXpert 技術對耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌耐藥基因分析

王 維， 王 林， 樊清清， 趙 亞

（1.西安市兒童醫院檢驗科，西安 710003； 2.西安市第一醫院檢驗科，西安 710002；3.西安市第一醫院藥劑科，西安 710002）

腸桿菌科細菌是醫院感染性疾病的主要致病菌，在免疫缺陷患者中易引起嚴重感染[1]。碳青霉烯類藥物如亞胺培南、美羅培南、厄他培南因其抗菌譜廣、抗菌作用強，已成為治療腸桿菌感染最強效β-內酰胺類藥物。但近年來，長期、大量、不規范使用該類抗生素導致對其耐藥的腸桿菌科細菌數量增加，使臨床抗感染治療面臨嚴峻的考驗[2]。腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥復雜，其中最重要是產碳青霉烯酶，按照Ambler 分類法，編碼碳青霉烯酶的耐藥基因主要分為A、B、D 三類，其中最流行的碳青霉烯類型包括KPC、NDM、IMP-1、VIM、OXA-48 等[3-6]。

GeneXpert 分子檢測平臺是一種半巢式實時熒光PCR 體外檢測系統，能彌補傳統細菌培養法及傳統PCR 方法檢測周期長、靈敏度差等缺陷[7]，且結果的穩定性好，已廣泛應用于結核分枝桿菌的利福平耐藥基因、耐甲氧西林金黃葡萄球菌（MRSA）、耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（CRE）耐藥基因等的檢測[8]。本文采用GeneXpert 技術方法，分析西安市第一醫院CRE 細菌耐藥基因表型，為指導臨床合理用藥以及預防和控制CRE的感染和暴發流行提供參考。

1 資料與方法

1.1 材料

菌株取自2017年3月至2019年3月西安市第一醫院微生物室從不同病區各種臨床標本中培養出的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等CRE 共70 株，剔除同一患者重復菌株；GeneXpert 微生物快速檢測系統、Xpert Carba-R試劑盒（美國賽沛公司）；全自動微生物鑒定及藥敏分析系統VITEK2 Compact、比濁儀、藥敏板卡AST-GN09、AST-N335（法國梅里埃生物制品有限公司）；血瓊脂培養基、MH 培養基（鄭州安圖生物工程股份有限公司）；基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜儀（德國布魯克公司）；生物安全柜、細菌培養箱（上海力康公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種鑒定及藥敏 采用基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜儀對收集的菌株進行鑒定復核。采用Vitek 2-Compact 全自動微生物鑒定及藥敏分析系統進行藥敏MIC 法實驗，藥敏結果采用CLSI2018 標準進行判斷，質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2.2 GeneXpert 法檢測耐藥基因 將已復蘇培養的菌株配制成0.5 麥氏單位菌懸液，取10 μL加至試劑盒樣本處理液中，經漩渦震蕩后，吸取約1.7 mL 混合液沿管壁加入試劑盒內，啟動檢測。

1.3 統計學方法

藥敏結果采用Whonet 5.6 軟件進行分析。其他數據采用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析，計數資料采用率或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌株分布

70 株分離菌株以肺炎克雷伯菌最為多見，共分離出26 株，占37.14%；其次是大腸埃希菌15株，占21.43%；弗氏枸櫞酸桿菌7 株，占10.00%；陰溝腸桿菌和產酸克雷伯菌各6 株，各占8.57%；其他菌株10 株，占14.28%。

2.2 標本分布

標本來源以痰液為主，共有41 株，占58.57%；其次為尿液和血液，均有13 株，占18.57%；膽汁3株，占4.28%。

2.3 科室分布

CRE 菌株康復重癥醫學科分離最多，共有20株，占28.57%；其次為神經外科和呼吸內科各13株，各占18.57%；泌尿外科10 株，占14.28%；消化內科5 株，占7.14%；其他科室9 株，占12.86%。

2.4 藥物敏感性實驗結果

藥敏結果提示CRE 對大部分β-內酰胺類藥物呈現高度耐藥性，耐藥率＞80%，對環丙沙星、左氧氟沙星、復方新諾明、妥布霉素耐藥率分別為63%、63%、63%、66.7%，對阿米卡星有較好的敏感性，敏感率為56.0%，未分離到粘菌素耐藥的菌株。見表1。

表1 70 株CRE 菌株藥敏實驗結果（%）

2.5 CRE 耐藥基因檢測結果

GeneXpert 方法檢測5 種耐藥基因結果顯示，攜帶碳青霉烯酶共57 株，占81.42%；其中，攜帶KPC 酶36 株，占51.43%；攜帶NDM 酶33 株，占47.14%；攜帶IMP-1 酶4 株，占5.71%；未攜帶可檢測碳青霉烯酶13 株，占18.57%。攜帶單一KPC酶22 株，占31.43%；攜帶單一NDM酶20 株，占28.57%；攜帶單一IMP-1 酶1 株，占1.43%；同時攜帶KPC和NDM 酶11 株，占14.28%；同時攜帶KPC 和IMP-1 酶1 株，占1.43%；同時攜帶IMP-1、KPC 和NDM酶2 株，占2.86%；其余型耐藥基因未檢出。質控菌株ATCC25922 未檢出耐藥基因。見表2。

表2 70 株CRE 菌株耐藥基因檢出情況

2.6 檢出耐藥基因數與患者預后分析結果

患者不同預后情況中，CRE 菌株耐藥基因檢出情況差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 CRE 菌株耐藥基因檢出情況與患者預后分析［例（%）］

3 討論

腸桿菌科細菌是院內感染的重要病原菌，可通過多種途徑進行傳播，碳青霉烯類抗菌藥具有較好的通透性和廣譜抗菌活性，是目前治療革蘭陰性桿菌效果較好的抗菌藥物。但是隨著該類藥物在臨床上的廣泛，CRE 菌株的檢出率呈逐年快速上升趨勢[9]。本文結果顯示，西安市第一醫院2017年3月至2019年3月共分離出70 株CRE，CRE 菌株以肺炎克雷伯菌為主，其次是大腸埃希菌，弗勞地枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌、產酸克雷伯菌所占比例較低，與文獻報道基本一致[10-11]。本文資料中CRE 菌株標本來源多樣，以呼吸、泌尿系統來源最多，與Zhang[10]等報道相似，符合腸桿菌科細菌的感染分布特點[12]。標本主要來源于康復重癥醫學科、神經外科、呼吸內科等重癥科室，此類科室患者病情嚴重，接受侵入性操作較多，免疫力較低下，加之長期應用抗生素治療增加耐藥菌株感染的機會，因此提示臨床應合理使用抗生素，避免重復給藥等行為的發生。

藥敏結果顯示，CRE 菌株對大多數抗菌藥物耐藥嚴重，特別是對β-內酰胺類藥物呈現高度耐藥，耐藥率＞80%，對亞胺培南和美羅培南的耐藥率均為92.6%；對環丙沙星、左氧氟沙星、復方新諾明、妥布霉素的耐藥率分別為63%、63%、63%、66.7%；對阿米卡星敏感性尚可，敏感率為56.0%，該結果與2017 CHINET 中國耐藥性監測結果一致[13]，當藥物缺乏或病情相對較輕時，可考慮應用阿米卡星等藥物。多黏菌素被認為是治療CRE最有效的抗菌藥物，目前未發現分離到多粘菌素耐藥菌株的報道。抗菌藥物的聯合應用（如多粘菌素類或阿米卡星聯合碳青霉烯類等）的療效均優于單藥治療[14-15]。

腸桿菌科細菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機制是產生碳青霉烯酶，碳青霉烯酶可按β-內酰胺酶家族Ambler 分類分為A、B、D 類。A 類最具有代表意義的酶型是KPC，也是最具有臨床意義的酶型。B 類主要包括NDM、IMP-1、VIM等。D 類主要為OXA-48[3-6]。本研究選取5種最常見基因（KPC、NDM、IMP-1、VIM、OXA-48）應用GeneXpert 技術進行檢測，結果顯示70 株CRE菌株檢測出碳青霉烯酶基因57 株，陽性率為81.42%。其中KPC 型36 株、NDM 型33 株、IMP-1型4 株，未檢出VIM 和OXA-48 型，提示腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶的主要耐藥基因為KPC 和NDM，與文獻[16]報道以NDM 型為主的結果存在差異，其原因可能與菌株來源及地理條件等因素有關[17]。經臨床回訪，是否檢出耐藥基因、檢出耐藥基因數量、是否為單一耐藥基因對患者病情轉歸無顯著性差異。

綜上所述，CRE 菌株由于具有復雜的耐藥機制，常表現為對多種抗菌藥物耐藥嚴重，本文基于GeneXpert 技術的快速、準確等特點對CRE 的基因分型和耐藥特征進行分析，為全面了解醫院CRE 菌株的耐藥現狀及耐藥機制提供了依據。為防止耐藥菌株的產生，臨床需根據藥敏結果合理使用抗菌藥物，同時要做好隔離防護和手衛生，以防止耐藥株傳播流行[18-19]。