異丙酚通過調(diào)節(jié)CIP2A/PP2A 通路抑制HepG2 細(xì)胞增殖

龐 榮，周 全， 李 茂

（1.江蘇徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮安醫(yī)院麻醉手術(shù)中心，淮安 223002； 2.江蘇淮安市第二人民醫(yī)院骨科，淮安 223002；3.江蘇淮安市婦幼保健院麻醉科，淮安 223002）

肝癌是常見惡性腫瘤之一，其特點(diǎn)是侵襲性強(qiáng)，且發(fā)病率逐年增高[1]。慢性肝炎、肝硬化及過量飲酒是肝癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素[2]。目前肝癌的治療手段主要包括手術(shù)切除及肝臟移植[3]。然而，研究[4]表明，手術(shù)過程中的操作及應(yīng)激等會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲。因此，手術(shù)中選用能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的麻醉藥物或方法對(duì)腫瘤預(yù)后有重要意義。

異丙酚是常用靜脈麻醉藥物之一，有高脂溶性并可以自由通過血腦屏障[5]，因此起效快、不良反應(yīng)少，臨床上主要用于誘導(dǎo)、維持麻醉和鎮(zhèn)靜等，同時(shí)異丙酚還是一種止吐藥。研究[6]表明，異丙酚除麻醉效應(yīng)外，還有許多其他有益效應(yīng)，包括免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等。近年來，發(fā)現(xiàn)異丙酚能夠顯著抑制人肝癌HepG2 細(xì)胞株的生長(zhǎng)和侵襲能力[3]。Sun 等[7]研究發(fā)現(xiàn)異丙酚可以通過升高lncRNA 的DiGeorge 綜合征臨界區(qū)基因5（digeorge syndrome critical region gene 5，DGCR5），并抑制Raf1/ERK1/2 和Wnt/β-catenin通路來抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Zheng 等[8]也發(fā)現(xiàn)異丙酚可以通過下調(diào)Twist1 的表達(dá)來抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）作為一種人們熟知的腫瘤抑制因子，在真核細(xì)胞內(nèi)含量十分豐富，是一種可以調(diào)控多種癌癥信號(hào)通路的因子，其活性的改變與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，已經(jīng)成為許多腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)[9]。蛋白磷酸酶2A 的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A）是PP2A 的內(nèi)源性抑制劑，通常與癌基因c-Myc 相互作用，通過抑制PP2A，從而穩(wěn)定c-Myc 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。本課題組前期研究證實(shí)異丙酚可以調(diào)節(jié)CIP2A 的表達(dá)，但是異丙酚是否可以通過CIP2A/PP2A 抑制肝癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展，卻鮮見報(bào)道，因此本文針對(duì)這一問題進(jìn)行相關(guān)研究。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

胎牛血清（FBS）、高糖培養(yǎng)基（DMEM）均購(gòu)自美國(guó)Life Technologies；異丙酚、二硫蘇糖醇（DTT）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨（AP）、二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自Sigma-Aldrich；MTT 購(gòu)自Solarbio；RIPA裂解液購(gòu)自Applygen；丙烯酰胺購(gòu)自Solarbio；CIP2A、PP2A、c-Myc 抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購(gòu)自Abcam；ECL 發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自諾唯贊生物科技有限公司；BCA 試劑盒購(gòu)自Cayman 公司；Trizol 購(gòu)自Transgene Biotech 公司；EvaGreen qPCR MasterMix 購(gòu)自ABM（Canada）公司；Lipofectamine 2000 購(gòu)自Invitrogen Life Technologies 公司；HepG2來自Procell Life Sicence ＆Technology 有限公司；CIP2A 過表達(dá)腺病毒（Ad-CIP2A）、CIP2A 干擾腺病毒（Si-CIP2A）和僅表達(dá)GFP 的腺病毒（NC組）購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT 實(shí)驗(yàn)測(cè)定異丙酚對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響 將HepG2 細(xì)胞以每孔2×104/mL 的細(xì)胞密度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL。細(xì)胞分成NC 組（空載腺病毒組）、Ad-CIP2A組（CIP2A 過表達(dá)組）及Si-CIP2A 組（CIP2A 敲低組），每組分別給予不同濃度的異丙酚（10、20 和30μM）培養(yǎng)24 h 后加入MTT 溶液繼續(xù)孵育4 h 后每孔加入200 μL 的DMSO，選擇490 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度A，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)各孔的A 值，以只加培養(yǎng)液、MTT 和DMSO 的3 孔作為調(diào)零孔。繪制生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞存活率=給藥組吸光度/NC組吸光度的平均值。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)HepG2 細(xì)胞CIP2A、PP2C 和c-Myc 的mRNA 表達(dá) 所有引物均為梓熙生物科技有限公司合成。不同濃度異丙酚孵育人HepG2 細(xì)胞24 h 后用Trizol 試劑提取總RNA，用TranScript 合成cDNA，用EvaGreen qPCR MasterMix 測(cè)定mRNA 表達(dá)水平。實(shí)時(shí)定量PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置如下：95 ℃，10 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共40 個(gè)循環(huán)。本研究主要用到的引物包括：CIP2A-F 為TACGAATTCATGCGACGG-CTGCTGATC，CIP2A-R 為TACCTCGAGGGAGAAGGCGAACTGTCCAG；β-actin-F 為ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG，β-actin-R為AGGAAGGAAGGCT-GGAAGAGTG；PP2A-F為CGGTGCTCATAGACGAACTC ，PP2A -R 為TCACTTCGGGTCCTTTCAAC。qRT-PCR 結(jié)果計(jì)算方法：目的基因的表達(dá)水平=2^-（目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct 值）。

1.2.3 siRNA 轉(zhuǎn)染HepG2 細(xì)胞 使用Lipofectamine 2000 將CIP2A siRNA 或?qū)φ誷iRNA 轉(zhuǎn)染進(jìn)HepG2 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h 鏡下觀察到明顯熒光表達(dá)，說明轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染成功后提取RNA 或者蛋白檢測(cè)CIP2A 敲低效率。靶向CIP2A 的siRNA 由上海吉瑪制藥有限公司設(shè)計(jì)合成，siRNA 序列如下：CIP2A siRNA 為5'-GGUGCACGUUUCAUCAAUU-3'；NC siRNA 為5'-CGGAUCGUCAAUGGCAGCU-3'。

1.2.4 Western blot 檢 測(cè)HepG2 細(xì) 胞CIP2A、PP2A 和c-Myc 蛋白表達(dá) 用不同濃度異丙酚孵育HepG2 細(xì)胞24 h 后提取總蛋白，BCA 試劑盒測(cè)定總蛋白質(zhì)濃度，將各組蛋白質(zhì)濃度調(diào)到同一水平，置于-70 ℃凍存（低溫冰箱）。制備10%SDS；聚丙烯酰胺凝膠，樣品加熱變性后，每孔加蛋白樣品20 μg 電泳，半干式電轉(zhuǎn)移儀轉(zhuǎn)膜到PVDF 膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，單克隆一抗（1∶2000 稀釋），4 ℃過夜，洗膜，按1∶5000 加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，洗膜后加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑，顯色。用Image J 對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量，采用Graphpad Prism 5.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)或方差分析。P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度異丙酚對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖的影響

不同濃度的異丙酚孵育三組HepG2 細(xì)胞24 h，MTT 法測(cè)定其對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響。隨異丙酚濃度增加，NC 組、Ad-CIP2A 組及Si-CIP2A組的HepG2 細(xì)胞的存活率均逐漸降低（P均＜0.05）。而Si-CIP2A 組相較于NC 組，HepG2 細(xì)胞的整體存活率顯著下降（P均＜0.05）；Ad-CIP2A 組與NC 組相比存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

2.2 異丙酚調(diào)節(jié)HepG2 細(xì)胞CIP2A/PP2A 通路相關(guān)基因的表達(dá)

異丙酚濃度≥20 μM 時(shí)，HepG2 細(xì)胞CIP2A mRNA 表達(dá)量均低于NC 組（P均＜0.05）；異丙酚濃度≥10 μM 時(shí)，PP2A mRNA 的表達(dá)量均高于NC 組（P均＜0.05），c-Myc mRNA 的表達(dá)量均低于NC 組（P均＜0.05）（圖2A）。siRNA 將CIP2A 敲低以后，異丙酚各濃度對(duì)CIP2A mRNA 表達(dá)水平無(wú)影響，各濃度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；而PP2A mRNA 的表達(dá)水平均升高（P均＜0.05），c-Myc mRNA 表達(dá)量均下降（P均＜0.05）（圖2B）。CIP2A 過表達(dá)后，CIP2A、c-Myc 和PP2A 的mRNA 在各異丙酚濃度組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）（圖2C）。

2.3 異丙酚調(diào)節(jié)HepG2 細(xì)胞CIP2A/PP2A 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

異丙酚濃度≥20 μM 時(shí)，HepG2 細(xì)胞中CIP2A蛋白表達(dá)均降低（P均＜0.05）；異丙酚濃度≥10 μM時(shí)，c-Myc 的蛋白表達(dá)水平均降低（P均＜0.05），而PP2A 蛋白表達(dá)水平均增加（P均＜0.05）（圖3A）。在CIP2A 敲低后，異丙酚各濃度對(duì)CIP2A 蛋白表達(dá)水平均無(wú)影響（P均＞0.05）；當(dāng)異丙酚濃度≥10 μM 時(shí)，PP2A 蛋白水平均升高（P均＜0.05），c-Myc 的蛋白表達(dá)量均下降（P均＜0.05）（圖3B、圖4）。CIP2A 過表達(dá)后，CIP2A、c-Myc 和PP2A的蛋白在各異丙酚濃度組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見圖3C、圖4。

3 討論

原發(fā)性肝癌是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，近年來發(fā)病率和病死率明顯升高[11]。早期原發(fā)性肝癌缺乏有效的生物標(biāo)志物，手術(shù)切除成為治療肝癌的最有效選擇，手術(shù)治療也較其他治療方式存活率高[12]。另外，合理的選擇麻醉藥物對(duì)于肝癌術(shù)后發(fā)展及其治療也有著至關(guān)重要的作用[13]。本課題組研究的異丙酚，也是常用的靜脈麻醉藥物之一。

研究[14]表明，許多麻醉藥物（如異丙酚、丙泊酚）對(duì)肝癌的術(shù)后存活率有顯著影響。關(guān)于異丙酚對(duì)肝癌的抑制作用研究也越來越多，其可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等[15-16]。也有文獻(xiàn)[17]報(bào)道，異丙酚可以通過調(diào)節(jié)PP2A 的表達(dá)而對(duì)高血糖進(jìn)行調(diào)節(jié)。異丙酚還可以通過下調(diào)PP2A 的表達(dá)，從而抑制內(nèi)皮黏附分子的表達(dá)及單核內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用[18]。有許多研究已經(jīng)證明異丙酚可以通過多種途徑抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展，如通過調(diào)節(jié)DGCR5 抑制肝癌[7，19]。CIP2A/PP2A 具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬、凋亡、抑制生長(zhǎng)等作用。Lu[20]等研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中，CD24 過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致PP2A蛋白表達(dá)量增加，并誘導(dǎo)mTOR/AKT 通路失活，從而增強(qiáng)自噬水平，調(diào)節(jié)耐藥性。Shu[21]等研究發(fā)現(xiàn)異蓮心堿可以減少PP2A/I2PP2A 相互作用并刺激絲氨酸536 位點(diǎn)上PP2A 依賴的p65 的去磷酸化來抑制肝細(xì)胞癌。Yu[22]等發(fā)現(xiàn)新型埃羅替尼衍生物TD52 可以通過抑制CIP2A，增強(qiáng)PP2A 活性來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

本課題組通過MTT 實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)異丙酚可以抑制HepG2 細(xì)胞的增殖。另外，實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果顯示，異丙酚能夠劑量依賴性地升高抑癌因子PP2A 的mRNA 水平，降低CIP2A 和c-Myc 的mRNA 水平來抑制肝癌細(xì)胞的增殖，這是因?yàn)镃IP2A是PP2A 的一種內(nèi)源性抑制劑，當(dāng)CIP2AmRNA表達(dá)降低的時(shí)候，PP2AmRNA 由于缺乏抑制劑會(huì)出現(xiàn)明顯的上升。當(dāng)敲低CIP2A 的表達(dá)后，PP2Am-RNA 表達(dá)升高，且CIP2A 和c-Myc 的mRNA 表達(dá)降低。同時(shí)我們還在蛋白水平驗(yàn)證了異丙酚對(duì)CIP2A/PP2A 通路的影響。同mRNA 表達(dá)水平一致，隨著異丙酚濃度升高，PP2A 蛋白表達(dá)水平逐漸升高，CIP2A 和c-Myc 蛋白表達(dá)逐漸降低，且在CIP2A 敲低后，CIP2A 蛋白水平整體降低的更明顯，HepG2 細(xì)胞存活率更低。腺病毒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，過表達(dá)CIP2A，再去檢測(cè)上述分子的mRNA和蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)CIP2A 后，隨著異丙酚濃度的增加，CIP2A 和c-Myc 的表達(dá)并無(wú)顯著性降低，說明過表達(dá)CIP2A 后，異丙酚抑制肝癌細(xì)胞的作用消失了，說明異丙酚是通過CIP2A 抑制肝癌細(xì)胞增殖的。過表達(dá)或敲低CIP2A 都證明了異丙酚可以通過調(diào)控CIP2A/PP2A 通路相關(guān)分子的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖。影響CIP2A/PP2A 通路是異丙酚抑制肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制之一，但可能不是惟一的機(jī)制，其他機(jī)制還有待后續(xù)研究。

綜上所述，異丙酚可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖，且機(jī)制與CIP2A/PP2A 有關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)為未來肝癌手術(shù)治療的藥物選擇提供了依據(jù)，也為肝癌治療提供了新的治療靶點(diǎn)。