懷牛膝多糖的提取分離及生物活性研究進展*

胡建平，孫延平，蘇發智，王洋洋，匡海學

（黑龍江中醫藥大學，教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

（懷）牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentata B1.的干燥根，呈細長圓柱形，挺直或稍彎曲，長15～70cm，直徑0.4～1cm，氣微、味微甜而稍苦澀，歸肝、腎經; 是一種中醫臨床上具有利尿通淋，逐瘀通經，引血下行，補肝腎，強筋骨藥用價值的藥材[1]。懷牛膝中含有多種主要化學成分，包括皂苷，甾酮類、多糖類、甜菜堿和多種微量元素等[2-5]。近年來，懷牛膝多糖（Achyranthes bidentata polysaccharides, ABP）受到了國內外學者的關注，藥理研究表明，ABP 是其重要藥效物質基礎并具有骨保護、抗癌、增強免疫等[6-8]生物作用；在臨床應用和保健品中具有很大的開發潛力。為更好地合理利用中藥懷牛膝資源，本文綜述了關于ABP 的分離提取、含量測定和生物活性方面的研究。

1 懷牛膝多糖提取方法

多糖屬于易溶于水的極性大分子化合物，但難溶于乙醇，所以常用水溶劑法提取多糖并采用一定濃度的乙醇去除多糖中單糖、生物堿、有機酸等小分子雜質。通常情況用熱水提取植物多糖，然后用高濃度的乙醇沉淀濃縮過后的水煎液得到粗多糖。采用傳統水煮提取法提取多糖，以苯酚-硫酸法檢測多糖含量，通過單因素考察、正交試驗優選水煮提取法中料液比、提取時間、提取次數對ABP 得率的影響；侯劍萍等人[9]得出各因素影響程度依次為：提取次數>提取時間>加水量，最佳工藝條件為：10 倍量水，提取 3 次，每次 2h；王媛媛等人[10]研究表明，ABP 的最佳提取工藝為料液比（g·mL-1）1∶13，提取時間 4h，提取次數3 次。傳統多糖提取方法往往存在有效成分損失大、工序復雜、提取周期長、提取率較低等缺點。郭婕等人[11]通過對微波輔助法提取懷牛膝中多糖，通過單因素及正交試驗篩選優化，確立了ABP 微波提取工藝條件：微波功率 600W、料液比（g·mL-1）1∶20、浸取溫度為70℃、微波處理時間4min，在此條件下，ABP 的提取率可達12.37%。通過微波輔助提取和熱水浸提兩種方法提取懷牛膝莖葉多糖，對懷牛膝莖葉多糖的提取率分別為103.79、89.58mg·g-1，表明微波提取比傳統水提具有更大的優勢，且微波輔助提取液表現出對農桿菌及大腸桿菌的抑菌效果較好[10]。魏濤等人[12]在傳統水提法的基礎上，利用超聲波輔助處理，在單因素實驗基礎上采用正交實驗得出提取ABP 的適宜工藝為超聲波功率1000 W、提取溫度 60℃、提取時間 60min、料液比（g∶mL）1∶30；在此提取工藝條件下，粗多糖得率為 6.1%，體外抗氧化性實驗表明，提取的ABP 具有較好的抗氧化性，對H2O2、O2-·和·OH 的清除率分別可達到 75.1%、90.3%和61.3%。

2 懷牛膝多糖的分離純化

由于初步制得的粗多糖中成分復雜，包含低聚糖、色素、蛋白質及其他小分子雜質，從而影響了多糖的純度。因此，為獲得高純度的多糖均一組分，需要對粗多糖進一步提純。色素在粗多糖中通常以游離或者結合態存在，常用去除多糖中色素的方法包括物理吸附法、氧化法和離子交換法等；其中活性炭吸附法和雙氧水氧化法多被采用。Sevage 法、三氯乙酸（TCA）法、酶解法等是常用來脫多糖蛋白的方法，在ABP 的提取純化中，侯劍萍等[9]發現脫蛋白工藝中，三氯乙酸（TCA）法優于 Sevage 法和鞣酸法，不僅可以有效去除蛋白，同時多糖成分損失較少，且可顯著去除表觀色素。此外，Sevag 法、殼聚糖絮凝法、三氯乙酸及酶解法這4 種脫蛋白方法經脫蛋白實驗對比后，發現酶解法能有效脫蛋白且具有操作簡單、損失小、效率高的特點，并且還具有維持多糖活性及預防試劑危害等優點[13]。由于粗多糖中含有一些蛋白復合物，因此，無法將多糖中的蛋白質徹底除去。粗多糖中的小分子如氨基酸的除去等常用透析法，該方法的關鍵是選擇一種適宜的透析膜，以免多糖樣品的損失；另外，離子交換樹脂和凝膠色譜柱也常用來除去多糖中的小分子雜質。

3 懷牛膝多糖的含量測定

多糖的含量檢測方法主要為化學法和色譜法兩類，其中化學法是利用組成多糖的單糖縮合反應為基礎建立的間接測量多糖含量的方法，多用于總多糖的含量測定，如苯酚-硫酸法，蒽酮-硫酸法等；這兩種方法由于操作簡單、反應快速、重現性好、試劑易獲取而在多糖含量測定被廣泛應用。李根林等人[14]對比兩種方法處理ABP，選擇顯色靈敏度較高、穩定性較好的苯酚-硫酸法測定8 個不同產地的ABP含量，結果顯示，河南武陟產地多糖較高達8.66%。而色譜法如氣相色譜法（GC）和高效液相色譜法（HPLC）可直接測定多糖本身，多用于均一多糖的純度測定。

4 生物活性

4.1 抗癌

多糖是一種具有免疫刺激活性而能夠對抗癌癥的物質，可通過調節機體的免疫系統達到抗癌的目的，這被認為是其抗腫瘤作用的主要機制且具有無毒的優點[15]。

目前，關于多糖抗癌作用方面研究比較多。通過對比空白對照組、多糖不同濃度治療組，發現不同濃度ABP 均可抑制肺腺癌細胞LTEP-a-2 的細胞分裂、增殖，促進細胞凋亡，且低濃度時表現的更為明顯，這與以往的研究結果相一致[16]，即低劑量ABP可顯著抑制C57BL/6 小鼠Lewis 肺癌生長，高劑量多糖無明顯抑制作用，但脾臟重量明顯增加，對小鼠的脾細胞毒作用明顯減弱，發現高劑量ABP 能顯著上調小鼠脾臟 IL-6 mRNA 和 TNF-α mRNA 的表達，提示小劑量牛膝多糖通過影響腫瘤細胞周期分布而抑制腫瘤生長。ABP 作為一種轉移化學預防藥物可通過靶向EGFR 和EMT 安全地預防非小細胞肺癌轉移，對EGFR 相關的非小細胞肺癌具有臨床意義[17]。另有研究表明，ABP 對S180 荷瘤小鼠有明顯抑瘤作用，且與化療藥物環磷酰胺（在無明顯抑瘤作用的劑量時）有協同抗腫瘤作用，ABP 能顯著提高S180 荷瘤小鼠脾細胞誘生LAK 細胞活性和TNF-β生成；對S180 細胞膜生化特性變化分析結果表明，ABP 引起細胞膜唾液酸含量升高、膜磷脂含量降低；提示ABP 對細胞膜生化特性與機體免疫功能的影響可能與其抗瘤機理有一定聯系。這些說明了ABP 在抗癌方面具備一定的治療潛力與開發價值。

4.2 免疫調節

機體的免疫功能包括特異性與非特異性機制。非特異性免疫也被稱為先天免疫或固有免疫，是指對所有具有一定抵抗力的病原微生物的防御，它沒有特殊的選擇性；特異性免疫是有選擇性地保護機體免受微生物或其產物的傷害，包括體液免疫和細胞免疫。通常情況下，免疫作用是多層面、多途徑共同參與的[18]。免疫功能則是通過對非特異性免疫巨噬細胞、特異性免疫T 淋巴細胞、體液免疫B 淋巴細胞、細胞因子及免疫器官等的考察顯現出來。研究發現, ABP 高劑量組能顯著提高雛雞的體液免疫、細胞免疫水平和免疫器官指數；表現在ABP 高劑量組的抗體效價高、可顯著提高雛雞外周血中CD3+CD4+T 淋巴細胞的百分率和CD4+/CD8+比值[19]。ABP 也可通過促進小鼠腹腔巨噬細胞Ana-1 細胞中TNF-α 因子分泌的途徑產生免疫活性來發揮抗炎活性，相比于川牛膝多糖體現出更強的優勢[20]。此外，免疫調節性植物化學物質可增強斷奶仔豬的免疫應答，在添加ABP 的斷奶仔豬中，通過調節抗體、補體 C3、C4，和細胞因子 IL-2、IFN-γ 的產生，提高了細胞和體液免疫水平，對感染的非特異性防御具有重要的保護作用[21]。這表明中草藥多糖ABP 作為一種天然的綠色飼料添加劑，可促進斷奶仔豬的免疫應答和健康生長，為斷奶仔豬提供了一種有效的抗生素替代品。

4.3 抗骨質疏松

ABP 是治療骨質疏松癥的重要中藥，表現在對去卵巢大鼠骨密度、骨礦含量、骨小梁厚度、骨小梁數量和生物力學性能均有顯著的改善作用，說明ABP 對去卵巢大鼠骨質疏松有顯著的治療作用[22]。基于UPLC/Q-TOF-MS 的代謝組學分析為評價牛膝多糖的抗骨質疏松作用，確定了ABP 能顯著增加戊二酰肉堿、磷脂酰膽堿（18∶1）和9-順式維甲酸等生物標志物，表明ABP 對脂質代謝有調節作用可能是治療骨質疏松癥重要機制。楊軍英等人[23]發現ABP結合游泳訓練能夠明顯延長部分肝切除（PH）大鼠的游泳致力竭時間（P＜0.01），使骨髓增生程度更活躍，有核細胞數增多，紅細胞數量減少，促進骨髓細胞 PCNA 的表達（和 PH 相比，P＜0.01）。這些反映了ABP 在治療骨質疏松癥方面有很好的潛力。

4.4 抗病毒

采用氯磺酸-吡啶法對ABP 進行硫酸化，用MTT 法檢測硫酸化后的ABP（ABPS）在MARC-145細胞上的抗呼吸綜合征病毒（PRRSV）活性，結果顯示，與未修飾的ABP 相比，ABPS 在較低濃度下表現出明顯的抗病毒活性，表明硫酸化修飾可以增強ABP 的抗病毒活性[24]。Peng 等人[25]對從懷牛膝中分離鑒定的ABP 硫酸化衍生物的體內外抗人類免疫缺陷病毒1 型（HIV-1）活性進行了研究，發現其對HIV-1 逆轉錄酶、整合酶和HIV-1P24 抗原均有活性，其抑制逆轉錄酶、整合酶的半數抑制濃度分別為（2.948+/-0.556）mol·L-1和 （0.155+/-0.030）mol·L-1，其腹腔注射吸收良好，但口服生物利用度較差。

4.5 抗衰老

Deng 等人[26]探討了ABP 對 D-半乳糖致衰老小鼠非酶糖基化的抑制作用及其機制，發現ABP 能降低D-半乳糖衰老模型小鼠血清AGE 水平、皮膚羥脯氨酸濃度和自發運動活性，提高淋巴細胞增殖和IL-2 活性，提高小鼠學習記憶能力和紅細胞SOD 活性；表明ABP 對D-半乳糖致衰老小鼠體內非酶糖基化均有抑制作用，且通過對比枸杞多糖提示ABP的抑制作用更強。

5 結論和展望

本文綜述了ABP 的提取分離、純化、含量測定的方法及生物活性的介紹。微波和超聲波輔助提取分離多糖方法比傳統水煎煮法更具優勢；ABP 具有廣泛生物活性，包括免疫調節、抗骨質疏松和抗癌等作用。目前，研究主要集中在多糖的提取分離、含量測定、結構表征與藥理作用方面，下一步需要進一步優化提純工藝，提高純度，明確其各級結構及構效關系，深入探討藥代動力學及藥理作用機制，以擴大我們對多糖功能效應的認識；本綜述也為懷牛膝更廣闊的應用前景和價值研究奠定了基礎。