環狀RNA在急性心肌梗死心臟損傷與修復中作用的研究進展

曾曉輝，盧帥，汪朝暉

華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院，武漢430022

急性心肌梗死（AMI）是一種嚴重威脅人類生命健康的缺血性心臟病，盡管近十年在AMI 的預防及救治上獲得了進步，但其發病率及病死率仍較高，全球每年有超過700 萬人受其影響［1］。目前 AMI 的發生主要是由于動脈粥樣硬化斑塊破裂并形成血栓，導致冠狀動脈急性、持續性堵塞，引起心肌細胞缺血壞死。AMI 發生后會引發心肌細胞壞死凋亡、梗死部位炎癥形成、心肌纖維化等一系列病理改變，嚴重降低患者心功能，同時伴隨心肌細胞再生、新生血管形成等代償修復過程。因此減少心肌細胞壞死凋亡、抑制心臟炎癥及心肌纖維化、促進心臟自我修復是治療AMI 的關鍵。環狀RNA（circRNA）是一種具有共價閉環結構的新型非編碼RNA，由于特殊的合成方式導致其不含5'末端帽子結構和3'多聚腺苷酸尾結構，因此circRNA 不易被核酸外切酶分解，在各類組織細胞中表達更加穩定［2］。近年來隨著基因芯片、二代測序以及生物信息學的快速發展，使得包括circRNA 在內的一系列非編碼RNA 成為了研究熱點。大量研究證實，circRNA 可在生物體內發揮重要生物學功能，在某些疾病（AMI、心力衰竭、心律失常等）的發生發展中起關鍵作用［3］。circRNA 可作為心血管疾病的潛在生物標志物和治療靶點。本文對circRNA 的生物學功能及其在AMI 心肌損傷、修復中的作用進行綜述。

1 circRNA概述

1.1 circRNA 的生物學特性 于20 世紀70 年代，circRNA 在植物感染的類病毒中被發現，被認為是由于反向剪接而產生［4］。1993 年，在哺乳動物中偶然發現了 circRNA 的大量存在［5］。2012 年，隨著RNA 測序技術和生物信息學的逐漸成熟，真核生物中circRNA 的豐度和普遍性才得到認可。circRNA的合成機制目前尚未完全闡明，通過反向剪接將下游的5'剪接位點與上游的3'剪接位點通過共價鍵連接形成外顯子環狀RNA［6］。由于其特殊的合成方式和生物學結構，circRNA 主要具有以下生物學特性：①circRNA 廣泛表達于人類細胞中，其表達量是mRNA 的 10 倍以上［6］。②由于 circRNA 的閉環結構，導致其被核酸酶降解的較少，比線性RNA 更穩定。③絕大多數circRNA 序列在物種之間具有高度保守性［6-7］。④絕大多數 circRNA 位于細胞質中，只有小部分位于細胞核［8］。⑤其主要來自外顯子，其他一小部分來自內含子或內含子片段。⑥其表達通常具有細胞、組織以及發育階段特異性。

1.2 circRNA的主要生物學功能

1.2.1 充當微小RNA（miRNA）的分子海綿 miR?NA 可與mRNA 的3'非翻譯區結合，進而抑制該mRNA 的翻譯。circRNA 的分子海綿作用是指其可作為競爭性內源性RNA 與miRNA 的結合位點互相結合，抑制miRNA 的生物活性，從而間接調控下游靶分子的表達。circRNA ciRS-7 是首個被發現能作為 miRNA 分子海綿的環狀 RNA［9］，其與 miR-7 具有70多個結合位點，能夠有效降低miR-7的生物活性，增強其下游靶基因的表達。ZHENG 等［10］發現，circHIPK3可通過充當miR-124和miR-193的分子海綿對癌細胞發揮生長調節作用。

1.2.2 參與RNA 轉錄的調節 盡管絕大多數circRNA 位于細胞質中，但也有少部分位于細胞核，參與 RNA 轉錄的調節。ZHANG 等［11］研究發現，環狀內含子RNA 在細胞核中表達豐富，可在核內通過與磷酸化的RNA 聚合酶Ⅱ相互結合，使其轉錄活性發生改變，從而發揮轉錄調控作用。另有研究發現，外顯子-內含子環狀RNA 是一種保留內含子的circRNA，定位于其親本基因的啟動子附近，并可與RNA 聚合酶Ⅱ結合，通過與保留在內含子中的5'剪接位點相互作用來提高轉錄效率，從而促進其親本基因的表達［12］。

1.2.3 調節mRNA 的穩定性 部分circRNA 還可調節 mRNA 的穩定性。HANSEN 等［13］研究發現，來源于小腦變性相關蛋白1（CDR1）基因的環狀反義RNA 可與CDR1 的mRNA 形成雙鏈結構，增強其穩定性。另有研究表明，小鼠巨噬細胞中的circ-Ras?GEF1B 可增強細胞間黏附分子 1（ICAM-1）mRNA 的穩定性，從而使LPS/TLR4 炎癥信號通路中ICAM-1的表達增加［14］。

1.2.4 通過與蛋白質相互作用發揮功能 circRNA可通過與蛋白質結合從而對RNA 結合蛋白（RBP）發揮招募、轉運以及蛋白支架的作用，調節RBP 生物活性。DU 等［15］研究表明，在小鼠成纖維細胞中，環狀RNA circFoxo3 可與細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1（P21）結合，這種circFOXO3-p21-CDK2 三元復合物的形成會抑制CDK2功能，從而阻止細胞周期進程。

1.2.5 具有蛋白翻譯功能 以往有觀點認為，circRNA 作為一種非編碼RNA 無法翻譯成蛋白質，但近年來研究發現，circRNA 也具備蛋白翻譯功能。第一個被科學家發現具有蛋白翻譯功能的circRNA是一種存在于丙型肝炎病毒中的單鏈環狀RNA，可產生一種具有122 個氨基酸的蛋白質［16］。YANG等［17］鑒定了人成纖維細胞中circRNA 所翻譯的幾種多肽，并且發現當腺苷被甲基化修飾時，起始密碼子上游的6-甲基腺嘌呤修飾的共有基序促進circRNA的翻譯能力。另有研究證明，circZNF609 可在小鼠以及人成肌細胞中與多聚核糖體相互作用，以剪接依賴性和帽依賴性的方式進行蛋白翻譯［18］。雖然circRNA 已被認為具有一定的翻譯能力，但是目前發現由于受其特殊的環狀結構影響導致翻譯效率不高，且circRNA 的翻譯產物（蛋白質及多肽）的功能尚不明確，有待于學者進一步探究。

2 circRNA在AMI心臟損傷與修復中的作用

2.1 circRNA 在 AMI中的表達譜 LIN 等［19］利用芯片技術檢測了AMI 患者和正常人外周血中circRNA的表達，共得到266個差異表達的circRNA，其中121個表達上調、145 個表達下調。WU 等［20］利用基因芯片進行了AMI 小鼠中circRNA 的表達譜分析，circRNA 芯片中共檢測到1 163個circRNA，其中差異表達的 circRNA 有 63 個，其中 29 個表達上調、34 個表達下調；從表達上調和下調的circRNA 中各選擇了6 個在心肌組織樣本中進行驗證，發現實時熒光定量聚合酶鏈式反應結果和芯片結果一致。用Tar?getScan 等在線數據庫分別預測了與mmu_circRNA_013216 和 mmu_circRNA_010567 相關的 miRNA，結果發現與mmu_circRNA_013216 相互作用的miRNA有 miR-181a-3p、miR-486a-5p 和 miR-486b-5p；與mmu_circRNA_010567相關性較大的miRNA 有miR-124、miR-141 和miR-200a。以上研究表明差異表達的circRNA可能在AMI的發生發展中起一定作用。

2.2 circRNA 在AMI 心肌細胞凋亡中的作用 心肌細胞凋亡在AMI 心肌損傷中起重要作用，其凋亡的嚴重程度直接影響患者的心功能及預后，是AMI的重要病理特征。WANG 等［21］研究發現，circRNA MFACR 在心肌缺血損傷后的細胞凋亡中具有重要作用；circRNA MFACR 可充當 miR-652-3p 的分子海綿抑制其活性，miR-652-3p 活性被抑制后有利于其下游靶分子線粒體三功能蛋白18（MTP18）表達上調。MTP18 能夠促進細胞線粒體裂變和心肌梗死小鼠心肌細胞凋亡。由此可知，circRNA MFACR 可通過MFACR/miR-652-3p/MTP18 信號軸來促進缺氧心肌細胞線粒體分裂和細胞凋亡。CAI 等［22］在AMI大鼠心肌中發現circ-Ttc3 表達顯著上調，利用重組腺相關病毒在大鼠體內干擾circ-Ttc3 的表達后發現，心肌梗死大鼠的心功能障礙加重，同時TUNEL實驗發現circ-Ttc3 沉默后也加劇了心肌細胞的凋亡；而circ-Ttc3 表達上調能夠抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶和半胱氨酸蛋白酶3 的表達，繼而抑制心肌細胞凋亡。隨后通過線數據庫預測以及熒光素酶實驗發現，circ-Ttc3可作為miR-15b的競爭性內源性RNA，通過上調其下游靶基因ADP-核糖基化樣因子2（Arl2）的表達來發揮心臟保護作用。Arl2 是一種小型三磷酸鳥苷結合蛋白，可參與氧化磷酸化和ATP 的產生。提示circ-Ttc3 也可通過調節ATP 的生成從而減輕心肌細胞凋亡。另有研究發現，AMI 心肌組織及體外缺氧誘導的心肌細胞中circ_0068655表達上調，上調的circ_0068655 能抑制細胞活力并促進心肌細胞的凋亡，提示circ_0068655 在AMI 心肌細胞凋亡中發揮了重要作用［23］。

2.3 circRNA 在梗死后心肌纖維化中的作用 心肌纖維化是一種由于心肌成纖維細胞過度激活進而引起細胞外大量纖維蛋白沉積的常見心臟病理改變，是AMI 心室重構的主要表現之一，可導致AMI患者心肌收縮和舒張功能障礙。心肌纖維化的形成機制復雜，目前關于AMI 心肌纖維化的機制尚未完全闡明。研究發現，circ_LAS1L 能夠抑制AMI 后心臟成纖維細胞的活化、增殖和遷移，并促進細胞凋亡［24］；circ_LAS1L 可與 miR-125b 結合并抑制其活性，從而促進其下游靶基因分泌型卷曲相關蛋白5（SFRP5）的表達，繼而減少α 平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、膠原纖維Ⅰ和膠原纖維Ⅲ的生成。表明circ_LAS1L 可 通 過 circ_LAS1L/miR-125b/SFRP5 軸來調節心臟成纖維細胞的生物學功能。BAI 等［25］研究發現，circRNA 010567 對AMI 大鼠心肌纖維化具有調節作用；利用小干擾RNA 干擾大鼠AMI模型中circRNA 010567 的表達后發現，心肌梗死大鼠的心功能明顯改善，心肌纖維化減輕。干擾組大鼠心臟組織中的轉化生長因子β1（TGF-β1）表達也隨之下降，提示將circRNA 010567 沉默后可能通過抑制TGF-β1信號通路來減輕AMI 心肌纖維化。另有研究發現，AMI 小鼠中circNFIB 表達降低，將circNFIB過表達后可通過調控miR-433 來抑制心臟成纖維細胞的增殖，繼而減輕心肌纖維化。

2.4 circRNA 在 AMI 心臟修復中的作用 AMI 發生后機體會啟動代償修復機制，對心臟結構和功能喪失進行一定程度的補救。其中，心肌細胞增殖和新生血管形成是AMI 心臟修復的兩個主要生物學過程，兩者之間的協同作用對心臟再生修復必不可少。SI 等［26］研究發現，circHipk3 在胎兒和新生兒心臟中高表達；circHipk3 過表達可改善AMI 小鼠的心功能，同時促進了梗死區心肌細胞增殖，并使得毛細血管密度增加，而心肌細胞凋亡和纖維化則有所減輕；進一步研究circHipk3 誘導心肌細胞增殖的機制，通過RNA 下拉實驗以及蛋白質譜分析發現circHipk3 可與Notch1 胞內結構域（N1ICD）結合，敲低circHipk3 的表達后可降低N1ICD 蛋白表達，表明circHipk3 對心肌細胞增殖的作用可能通過調節N1ICD穩定性來實現。同時，WANG等［27］研究發現，缺氧誘導的心肌細胞所分泌的外泌體環狀RNA circHIPK3 能夠調節AMI 后的心臟血管生成；circH?IPK3 可抑制 miR-29a 活性，而 miR-29a 可通過靶向血管內皮生長因子A（VEGFA）來抑制心臟內皮細胞的增殖、遷移。因此circHIPK3 可通過miR-29a/VEGFA 信號軸來促進心肌內皮細胞的增殖、遷移和血管形成；同時體內實驗發現外泌體中的circHIPK3能夠使AMI 小鼠心臟梗死區的血管密度增加，促進新生血管形成并改善了心肌纖維化。

circRNA 還可通過與蛋白質直接結合來完成其對AMI 后心臟結構和功能的修復。GARIKIPATI等［28］在AMI 小鼠心臟以及缺血性心肌病患者的心臟組織中發現circFndc3b 表達降低，在AMI 小鼠中將circFndc3b 過表達可改善小鼠左心室收縮功能；同時還發現circFndc3b 過表達使得AMI 小鼠心臟毛細血管密度和α-SMA 陽性小動脈增加，心肌纖維化減輕。該作用可通過FUS/VEGF-A 信號軸介導。以上研究為探索AMI 心臟修復治療提供了新的研究思路。

2.5 circRNA 可作為AMI 潛在的生物標志物 當AMI 發生后，由于心肌組織的損傷導致更多的心肌肌鈣蛋白（cTn）和肌酸激酶（CK）釋放到外周血中，使得血液中的cTn 和CK 含量增加，因此臨床上cTn和CK 可作為AMI 的診斷標志物。然而，心肌炎、肺動脈栓塞等其他疾病以及正常人劇烈運動后也可有cTn 和 CK 的異常釋放［29］，因此二者特異度不高，且穩定性較低。研究證實，circRNA 具有穩定性高、表達豐富、種類多樣等特點，可作為心血管疾病、癌癥以及免疫紊亂等疾病的生物標志物［30］。circRNA MICRA 是一種主要存在于外周血細胞中的與心肌梗死相關的 circRNA。VAUSORT 等［31］發現，與健康對照組相比，AMI 患者外周血細胞中circRNA MI?CRA 的表達低，MICRA 是左室功能障礙的預測指標。SALGADO-SOMOZA 等［32］研究也發現，左室射血分數明顯降低的AMI 患者外周血細胞中circRNA MICRA 的表達低于射血分數保留或射血分數輕微降低的患者。表明circRNA MICRA 有可能成為評估AMI 患者預后的生物標志物，但目前有關circRNA作為AMI生物標志物的研究較少。

綜上所述，circRNA 具有多樣化的生物學功能，并在AMI 心臟損傷修復中具有重要作用。雖然目前對circRNA有了一定了解，但對circRNA的研究仍處于起步階段。對circRNA 是否具有其他生物學功能、以何種方式分解、在AMI 中是否參與了梗死后心肌炎癥的形成、何時可在臨床上作為AMI 的診斷標志物等一系列問題仍知之甚少。隨著芯片技術及生物信息學的發展，相信circRNA 在AMI心肌損傷、修復中的作用將被深入研究，為AMI 的診斷和治療提供新的理論依據。