酵母雙雜交技術研究進展

劉國濤，張樹宇，魏 凱*

（1.山東省濱州市畜牧獸醫管理服務中心，山東 濱州 256600； 2.山東農業大學動物科技學院，山東 泰安）

酵母雙雜交系統是研究活細胞內蛋白質與蛋白質之間相互作用的一種強大且常用的分子生物學技術。該技術不僅能夠檢測細胞內穩定的蛋白互作，而且可以檢測微弱的或者瞬時的蛋白相互作用。實驗方法具有成本低，易操作，設計簡單等一系列優點，在生物學實驗中的應用十分廣泛。酵母雙雜交技術在眾多生物學相關領域應用廣泛且前景廣闊。本文對酵母雙雜交技術的基本原理、應用、發展前景等方面進行綜述。

蛋白質在生命活動的的許多過程發揮著不可或缺的作用，如細胞間的信號轉導，胞內物質的代謝及細菌病毒對細胞的入侵等。研究蛋白質相互作用對于人們深入了解預防傳染病，靶向治療多基因疾病有重要意義。酵母雙雜交技術設計簡單及其對微弱或短暫蛋白互作的檢測能力使其在互作蛋白篩選過程中得到廣泛應用。

1 酵母雙雜交技術的基本原理

1986年Keegan等[1]發現了酵母細胞中的Gal4結構可結合特定的DNA序列（上游激活域，UAS），從而在半乳糖存在的情況下激活轉錄。1989年，Fields和Song通過描述一種基因系統來檢測釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中直接的蛋白質-蛋白質相互作用，徹底改變了蛋白質相互作用分析[2]。Gal4有兩個不同功能域即：N端DNA結合域（DNA-BD）和C端（轉錄）激活域（AD），兩個單獨的域均獨立于另一個而維持其功能。在誘餌蛋白上加上BD結構域，在獵物蛋白上加上AD結構域，當誘餌和獵物結合時，BD和AD結構域在空間上相互接近，發揮轉錄因子的作用。DNA-BD結構域識別并結合GAL上的UAS（上游激活序列），AD結構域激活基因轉錄，從而使酵母特定基因如LzcZ、HIS3、MEL1、ABAr的表達，使酵母菌能夠在特定的營養缺陷培養基上生長，同時水解培養基上的X-α-Gal[2]，使無色透明的X-α-Gal分解從而使菌落產生藍斑，降低了假陽性率；也可通過AbA抗生素篩選報告基因的表達而在抗生素培養基上生長，提高了準確性。

2 酵母雙雜交技術的應用

2.1 通過酵母雙雜交技術篩選互作蛋白

從cDNA文庫中尋找與已知蛋白相互作用的未知蛋白是酵母雙雜交技術最為重要的用途[3]。孫杰等[4]利用酵母雙雜交統從人胚胎肝臟cDNA文庫中篩選到三個與JNKK2相互作用的蛋白，為深入探究JNKK2在肝臟中的作用奠定了基礎。Zhao等[5]通過酵母雙雜交系統篩選和鑒定與環狀泰勒蟲半胱氨酸蛋白酶（TaCP）相互作用的宿主蛋白CRBN和Ppp4C，與CRBN和Ppp4C的相互作用表明TaCP可能參與調節信號傳導途徑和細胞增殖，這有助于了解環線蟲與宿主細胞之間 的相互作用。Rana等[6]通過酵母雙雜對人腦cDNA文庫進行篩選，確定了7種宿主蛋白（CCDC130、CPNE6、POLR2C、MAPK9、EIF4A2、EIF1A1和EIF3I）作為CHIKV nsP2的假定相互作用子，為更深入的研究提供了基礎。

2.2 通過酵母雙雜交技術繪制蛋白質相互作用圖譜

進入新的世紀，生命科學技術飛速發展，蛋白質成為了當前研究重點，繪制蛋白質互作圖譜對研究生命活動調控有十分重要意義[7]。Xiang等[8]繪制了脊髓灰質炎病毒P3蛋白的完整蛋白連鎖圖，研究聚合酶3Dpol與VPg和3AB的遺傳變異的相互作用。Teutschbein等[9]繪制結核分枝桿菌ESAT-6分泌系統1（ESX-1）的蛋白質連鎖圖，研究各種蛋白質之間的相互作用，以此作為藥物開發的序幕。

2.3 通過酵母雙雜交技術篩選藥物靶標

在過去的30多年里，酵母雙雜交系統已經有了越來越廣泛的應用，在藥物的發現和開發過程中也發揮著重要的作用。Lai等[10]利用酵母雙雜交技術鑒定與弓形蟲SAG1相互作用的宿主蛋白，發現富含賴氨酸的智人螺旋卷曲蛋白與SAG1相互作用，該蛋白可以作為疫苗研究中的潛在藥物靶標。Pfefferle等[11]利用酵母雙雜技術篩選鑒定免疫菌素（PPIA、PPIB、PPIH、PPIG、FKBP1A、FKBP1B）作為CoV非結構蛋白1（Nsp1）的相互作用伴侶，發現環孢菌素A（CspA）對親環蛋白的抑制作用會阻止所有屬CoV的復制，包括SARS-CoV，人CoV-229E和-NL-63，貓CoV以及禽類傳染性支氣管炎病毒。CspA的非免疫抑制衍生物可作為廣泛的CoV抑制劑，應用于人和動物的CoV。

3 酵母雙雜交優勢及該技術存在的缺點

酵母雙雜交系統已被證明是一種有用且靈敏高效的方法，不僅可以檢測胞內穩定的相互作用蛋白，還可以檢測微弱和短暫的蛋白相互作用。由于它也相對容易實現且價格便宜，因此酵母雙雜交系統迅速成為檢測蛋白質-蛋白質相互作用的首選系統。

3.1 酵母雙雜交篩選互作蛋白的優勢

以往的蛋白互作研究技術均是進行的體外實驗，如免疫共沉淀、交聯、親和層析等，這些實驗方法受外界因素干擾較大，且可能會和一些在空間上本不可能接觸的蛋白互作，酵母雙雜交技術因為是在活細胞內進行的，不受外界因素影響，同時也對瞬時存在的和不穩定的蛋白有較好的檢測效果。

3.2 酵母雙雜交技術存在的缺陷

酵母雙雜交系統簡單、易操作、多樣性及高通量的能力使其成為最受歡迎的蛋白質互作分析篩選方法，但所有的酵母雙雜交方法都存在假陽性和假陰性問題。（1）假陽性：某些誘餌蛋白或獵物蛋白具有激活轉錄的功能，獵物-BD融合基因與誘餌-AD融合基因無需相互接觸就能啟動轉錄系統，發生自激活現象從而導致假陽性結果。此外，一些蛋白可能會與其他蛋白形成蛋白復合體，激活報告基因，使酵母雙雜產生假陽性。免疫共沉淀（CO-IP）和pull-down技術也用來驗證酵母雙雜的篩選出來的互作蛋白，經過這三種技術篩選出來的互作蛋白才有可能是目的蛋白。（2）假陰性：在酵母菌株中表達的蛋白質可能有毒性，從而抑制酵母的生長或其報告基因的表達。為了抑制背景表達而在培養基中添加的氨基三唑[12]（3-AT，3-Aminotriazole）也會對菌株產生一定毒性，一些較弱的蛋白質互作可能會被掩蓋。此外，融合的酵母表達蛋白可能會引起空間位阻，從而阻礙蛋白相互作用，導致假陰性。

4 酵母雙雜交技術的發展

4.1 基于膜系統的酵母雙雜交（Membranebasedyeasttwo-hybridsystem）

在真核細胞中，很多蛋白質都是膜相關蛋白質，由于其疏水特性及不位于核內，因此經典的酵母雙雜交系統很難用于檢測蛋白互作。1998年Stagljar等[13]開發出了基于分裂泛素的遺傳系統，用于分析體內膜蛋白之間的相互作用。膜酵母雙雜交系統利用基于對體內重組泛素加工檢測的泛素分裂法。在X和Y蛋白相互作用時，泛素重組，使蛋白裂解，釋放轉錄因子從而啟動報告基因的表達，該系統可用來檢測膜蛋白間的相互作用。

4.2 酵母雙雜交文庫的高通量篩選

高通量篩選系統大大提高了文庫篩選效率。Yachie等[14]設計的BFG-Y2H系統利用Cre重組酶通過條碼標記每個誘餌和獵物基因，通過高通量測序同時識別所有的相互作用蛋白，此外BFG-Y2H系統還可檢測自激活誘餌的相互作用。Yu等[15]開發出的新方法可僅使用10ng文庫并通過15個循環擴增后進行高通量測序，較傳統的方法能夠評估插入的基因數、基因豐度等指標。

5 展望

酵母雙雜交技術建立30多年以來，雖然存在假陽性、假陰性等缺陷，但仍得到了廣泛的應用及相應的發展，酵母單雜（yeast one-hybrid）、酵母三雜（Yeast Three-Hybrid）等技術也相繼問世其快速、高效等特點受到學界廣泛認可，酵母雜交技術對生物學研究及藥物的研發功不可沒，必將在今后的研究中發揮更重要的作用。