酒精性心肌病心肌損傷的分子機制研究進展

董莎莎，肖強，李元民

山東第一醫科大學第二附屬醫院，山東泰安271000

酒精性心肌病（ACM）是由于長期大量飲酒，導致心肌細胞變性，表現為心臟擴大、心功能不全的一種心肌病。臨床上以左心室擴張、左心室收縮功能障礙為特征，酒精性心肌病每年可引起全球超過40萬人死亡［1］。過量飲酒造成急性和慢性的乙醇中毒與心肌損傷密切相關［2］。在ACM 的發病過程中，大量心肌細胞中分子改變會打亂正常的生理過程，擾亂心肌功能，并使心肌蛋白穩態失衡，最終導致心血管器官的損傷。現從心肌收縮力的變化和心肌蛋白調控兩方面闡述急性和慢性乙醇攝入后細胞內蛋白穩態變化，同時揭示乙醇導致的心肌損傷分子機制［3］。

1 乙醇對心肌功能的損傷

乙醇及其代謝產物對心肌的毒害主要體現在以下方面：①破壞心肌細胞膜的完整性；②其代謝產物乙醛對心肌細胞的毒害作用；③影響心肌細胞中陽離子的轉運；④調節部分重要心肌蛋白，影響其收縮和舒張功能。

1.1 急性乙醇中毒引起心肌舒張功能障礙 心肌細胞的靜息電位在急性乙醇攝入后并無明顯變化，但在乙醇攝入72 h 后會顯著延長［4-5］。多數數據表明急性乙醇中毒后，心臟復極速度降低。急性乙醇攝入時，心臟的功能呈現乙醇劑量性變化，即低劑量的乙醇不能引起心肌功能的相應變化［5-6］。而高劑量的乙醇改變了心肌細胞中鈣的富集和循環，細胞內鈣離子通透性減低，這些變化共同證明急性乙醇中毒能引起明顯的心肌舒張功能障礙［7］。

急性乙醇中毒能通過電信號刺激降低心肌細胞內鈣的增加，加快心肌細胞內鈣的衰減速度，同時降低心肌細胞對鈣的重吸收。另外，乙醇的急性中毒降低了肌漿網鈣-ATP 酶（SERCA-2a）的表達，同時降低了SRECA 的磷酸化活性，這與乙醇導致的心肌收縮的鈣吸收障礙相一致［6］。

1.2 慢性乙醇攝入導致心臟收縮功能減退 慢性乙醇攝入并不能改變靜息電位時間和鈉鈣離子泵相關蛋白的磷酸化水平。但長期乙醇攝入能引起心肌細胞內鈣的快速衰減，從而引起心肌收縮力的降低［8］。心臟的收縮性能與心肌的收縮速度和舒張速度有關，而心肌細胞中鈣的分布和運動調控心肌的收縮和舒張。因此，長期的乙醇攝入會導致心臟收縮功能的減退。

1.3 乙醇代謝物損傷心肌功能 體內乙醇代謝的主要的產物是乙醛。在乙醇的代謝過程中，機體內的乙醇可在乙醇脫氫酶（ADH）的作用下分解為乙醛，而乙醛則是乙醇代謝的直接產物。乙醛對心肌細胞的損傷主要體現在對其結構和收縮力的影響，包括擾亂細胞對鈣的處理和心肌的收縮興奮偶聯［9］。

急性大量攝入的乙醇在體內轉化為乙醛的過程中，ADH 的作用至關重要。近期研究表明，ADH 過表達的小鼠在急性乙醇中毒時其心肌細胞的收縮達峰時程（TPS）、復長速率（±dL/dt）和舒張90%時程（TR90）顯著延長，這與乙醛直接處理小鼠引起的其心肌細胞損傷相似。在乙醇作用下，ADH 過表達改變了鈣在心肌細胞中的分布，可引起心肌細胞內鈣超載。表明乙醇代謝產物乙醛能導致心肌功能受損［3，5］。

在長期乙醇攝入時，細胞色素同工酶（CYP2E1）可將乙醇轉化為乙醛，而乙醛的產生可致心肌收縮力受損。抑制CYP2E1 表達后，乙醇的長期慢性攝入不會導致心肌細胞靜息時間、TPS、±dL/dt）和TR90 出現明顯變化。另外，抑制CYP2E1 表達后，乙醇導致的心肌細胞鈉鈣泵蛋白的變化并不明顯。這些數據證實過量的乙醛對心功能的負面影響［3，10］。

乙醇代謝的另一個重要產物是乙酸，乙醛可在酶的作用下轉變為乙酸，而乙酸對心肌細胞的損傷并不明顯。在這過程中，影響乙醛轉化為乙酸的重要的酶是乙醛脫氫酶（ALDH-2），抑制ALDH-2 的表達會造成乙醛的蓄積，從而加重乙醇對心肌的損傷。乙醇可誘導缺乏ALDH-2 的心肌細胞（從AL?DH-2 缺陷小鼠中分離）出現嚴重的損傷，這種損傷主要表現在±dL/dt）和TR90 顯著延長。相反，過表達的ALDH2會加速乙醛到乙酸的轉化，此時乙醇誘導的心肌細胞的損傷被完全抑制［11］。

1.4 乙醇損傷心肌收縮力的相關信號途徑 乙醇能使位于雷帕霉素受體蛋白復合物（mTORC1）上游的胰島素樣生長因子（IGF-1）信號通路下調。然而，IGF-1 在乙醇導致的心肌功能不全上呈現兩面性。心肌特異性的過表達的IGF-1 降低了乙醇誘導的心肌細胞收縮峰值的衰減率和鈣信號；相反，肝臟中缺乏IGF-1 的小鼠，乙醇引起的心肌收縮力并無明顯變化（主要體現在心電圖峰值的縮短和細胞內鈣離子的衰減）［3］。

單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）是一個mTORC-1 的抑制子和自噬激活子。現有證據表明抑制AMPK的活性在急性乙醇中毒時對心臟起保護作用；另外，AMPK 的缺陷阻止了乙醇誘導的心肌細胞收縮力改變［12］。因此，AMPK 激活對mTORC1 的抑制作用是乙醇干擾心肌細胞收縮功能的機制之一。

2 乙醇對心肌蛋白合成的影響

酒精性心肌病與心肌蛋白的合成和調節信號通路密切相關。心肌蛋白合成的降低部分歸因于機體總蛋白合成的抑制，而潛在的致病機制取決于機體對乙醇的耐受度。慢性乙醇攝入導致心肌蛋白合成減弱，這與mRNA轉錄激活和延伸受損有關；而急性乙醇中毒會選擇性的抑制轉錄激活。乙醇對轉錄調控蛋白的影響主要體現在降低轉錄因子（eIF-4E）連接蛋白（4E-BP1）的磷酸化抑制mRNA 轉錄和蛋白合成。前期報道證明mTORC-1 可通過磷酸化4EBP1 和S6K1 調控心肌細胞的合成。急性和慢性的乙醇中毒均能降低mTORC-1 激酶活性最終抑制心肌蛋白合成［13］。

2.1 慢性乙醇攝入對心肌蛋白合成的影響 在心肌蛋白合成途徑中，mTORC-1 表達上調可增加心肌蛋白合成；相反，mTORC-1 的抑制會降低心肌蛋白合成。慢性乙醇攝入能通過降低S6K1 和4E-BP1 的磷酸化抑制mTORC-1 和mTOR 自身磷酸化，從而降低心肌蛋白合成。但動物的種群、年齡和性別等在對乙醇的應激上會有潛在不同。而一系列的研究亦證明心肌的mTOR 信號具有年齡、性別和底物獨立性的特征［14］。

慢性乙醇攝入能調控mTORC-1 上游多種信號效應器，包括激活AMP 蛋白激酶（AMPK）和DNA 損傷應激蛋白（REDD1）。胞內應激能使磷酸化的AMPK 增加，最終導致mTORC-1 和蛋白合成的抑制。而作為mTORC-1 的抑制子，在慢性乙醇攝入時，REDD1 蛋白在成年和老年小鼠心肌細胞中的表達顯著增高，提示REDD1 在慢性乙醇性心肌病中調控心肌蛋白合成和降解的作用［15］。

作為mTORC1經典途徑上游能被胰島素激活的重要蛋白，慢性乙醇攝入時心肌的蛋白激酶B（Akt）變化并不明確。Akt 的Ser473 和Thr308 位點磷酸化對于信號通路的完全激活至關重要，但是這些位點在同一個試驗中呈現不同的調控。這種差異可能與動物模型、乙醇攝入量及動物對低劑量乙醇的耐受度引起的磷酸化相關［16-17］。另外，Akt的磷酸化效應與其上下游調控蛋白的磷酸化水平一致。這包括在慢性乙醇攝入條件下，Akt信號通路抑制子PTEN 的磷酸化上升導致的Akt 信號通路抑制［8］。Akt 可能同時通過抑制結節性硬化復合物蛋白（TSC2）的磷酸化影響mTORC-1 信號。迄今，慢性乙醇攝入對TSC2 蛋白磷酸化的影響在心臟中并未有報道，REDD1 可能通過TSC2 獨立的分子機制影響mTORC-1信號通路［15］。

與Akt 信號通路的變化不同，慢性乙醇攝入誘導的胰島素信號改變亦可能參與心肌蛋白合成。首先，乙醇的攝入會導致人心臟中IGF-1 表達下調。其次，長期的中高劑量的乙醇攝入會導致葡萄糖轉運蛋白（GLUT4）的mRNA 和蛋白降低，而低劑量則不能引起這種變化［16］。

2.2 急性乙醇攝入對心肌蛋白合成的影響 早期研究揭示了急性乙醇攝入降低心肌蛋白的合成和mTORC-1的信號活性，這與mTORC-1活性下降相一致。在小鼠的試驗中，雄鼠的AMPK Thr172 位點和Raptor Ser792位點的磷酸化活性在急性乙醇攝入時升高，而mTOR Ser2448 位點的磷酸化活性明顯降低［5］。高劑量急性的乙醇攝入降低了Akt Ser473 的磷酸化效應，而低劑量的急性乙醇攝入增加了Akt Ser473 的磷酸化效應。這說明Akt Ser473 位點的磷酸化活性受急性乙醇攝入的劑量調控［1］。

MAPK 信號是心肌蛋白合成的補充途徑，急性乙醇的攝入能負調控MAPK信號從而降低心肌蛋白的合成，這種同時具有性別和劑量的獨立性。在連續的重度乙醇攝入后，磷酸化的p38被激活，然而細胞外調節蛋白激酶（ERK1/2）和c-Jun 氨基端激酶（JNK）的磷酸化效應并未改變。在急性灌注乙醇的大鼠中，低濃度的乙醇灌注降低了p38、ERK1 和ERK2 的磷酸化，這與ERK1 和p38 的mRNA 表達趨勢相同；中濃度的乙醇灌注與低濃度乙醇灌注相同，但其mRNA 并無明顯變化；而高濃度的乙醇灌注既未改變p38 和ERK1 的mRNA 表達，亦未改變ERK1的磷酸化［18］。急性乙醇對ERK 的劑量依賴性調節在雌性大鼠的左心室組織中得到證實，低劑量乙醇未引起Akt 或ERK 磷酸化水平改變，而較高劑量則使其顯著增加［17］。盡管MAPK信號的激活與急性乙醇密切相關，但心肌蛋白代謝與乙醇誘導的MAPK功能改變的關系并不明確。

3 乙醇對心肌蛋白降解的影響

維持心肌蛋白平衡的另一方面是通過降解途徑分解損傷的細胞器和蛋白。蛋白的降解有兩條重要途徑，分別是泛素化蛋白酶體途徑（UPP）和自噬途徑。泛素化蛋白酶體途徑是降解代謝的主要途徑，泛素化的蛋白被蛋白酶體復合物降解。泛素化是由E1、E2 和E3 連接酶介導的一系列酶促反應。蛋白酶體降解最初發生在由20 S亞基和調控顆粒組成的在26S 蛋白酶體上。早期研究表明，總的肌肉纖維和肌肉蛋白的降解在慢性乙醇飼喂和正常飼喂中無明顯差別［15］。

自噬能參與細胞器的降解從而維持細胞的穩態，吞噬掉的細胞器和蛋白能為饑餓的細胞提供必要的能量［19］。乙醇誘導的細胞自噬還不甚明了，然而缺乏自噬相關蛋白（Atg 5）會導致心肌細胞的肥大，左心室擴張和心肌的收縮功能不全。在營養匱乏時，AMPK 激活后增加ULK-1（ULK-1）在Ser317和Ser777 位點的磷酸化從而促進自噬。相反，營養富足的條件下會激活mTOR1，mTOR1打斷了AMPK 和磷酸化的ULK1 之間的聯系從而抑制自噬的發生［20］。相較于蛋白降解的自噬途徑，乙醇攝入導致的心肌蛋白泛素化蛋白酶體降解途徑研究較少。

3.1 急性乙醇攝入導致的自噬 急性乙醇攝入導致自噬的微管相關蛋白（LC3B）-Ⅱ、LC3B-Ⅱ/Ⅰ和Atg7 總量增高，同時ULK-1 Ser575 位點磷酸化的降低表明自噬的激活。H9c2 細胞試驗中發現在乙醇攝入時添加溶酶體抑制劑，細胞中LC3 和p62 蛋白表達及LC3 陽性自噬體的形成并未增強，這與乙醇增加自噬的結果一致。相反，在乙醇處理細胞前添加溶酶體抑制劑，則會減弱LC3-Ⅱ和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白的表達，但不能改變LC3B 蛋白和LC3B 陽性細胞的總數，表明急性乙醇攝入對自噬的影響可能很小，但其真實性值得驗證［4-5］。

急性乙醇攝入會導致AMPKα2 下調，與急性乙醇中毒與自噬增加導致的AMPK 激活有關。另外，過表達乙醇脫氫酶（ALDH2）會導致AMPK 活性 的 下 調，通 過 下 調Beclin1、Atg7、LC3B-Ⅱ和LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達降低乙醇導致的自噬［4-5］。乙醇誘導的細胞自噬中添加AMPK 激活劑后AICAR 和LC3B-Ⅱ的表達并無明顯的變化。相反的，添加AMPK 的抑制劑能夠阻止乙醇導致的LC3B-Ⅱ和LC3B-Ⅱ/Ⅰ的增強［12］。這證明了能量轉化在乙醇誘導的自噬激活中起重要的作用。H9c2 的細胞試驗證明了乙醇誘導的AMPK 獨立的自噬增加，同時證明了短期的乙醇攝入會通過AMPK-ULK1 激活心肌細胞的自噬。

3.2 慢性乙醇攝入導致的自噬 長期飲酒對心臟自噬的影響研究較少，高濃度的乙醇長期攝入會增加Atg7 的蛋白表達和AMPK Thr172 位點的磷酸化。然而，LC3B-Ⅱ/Ⅰ和Atg 12 的蛋白無明顯變化［15］。相反，LC3-Ⅱ、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Atg7和LC3B 陽性心肌細胞的數目在低濃度乙醇長期飼喂的小鼠中顯著增加，同時還發現LC3B-Ⅱ/Ⅰ增加而自噬基因Beclin 1并無變化。這可能與乙醛誘導的LC3B-Ⅱ，LC3B-Ⅱ/Ⅰ和Atg7 蛋白的變化有關，同時受乙醇導致的ADH（乙醇脫氫酶）影響［15］。過表達的乙醛脫氫酶（ALDH2）清除了乙醛，阻止了LC3B-Ⅱ/Ⅰ的增長。因此，長期飲酒會改變心臟自噬的結論缺乏足夠的確鑿證據。

綜上所述，乙醇導致的心肌收縮力受損主要與乙醇及其代謝產物損傷了心肌細胞的鈣處理能力以及細胞中鈣的分布，同時通過AMPK 的激活干擾心肌細胞的收縮功能。而乙醇對心肌蛋白的代謝的影響主要體現在心肌蛋白的合成和降解兩個方面，一方面，乙醇可以通過降低mTORC-1激酶活性最終抑制心肌蛋白合成。另一方面，乙醇可以通過心肌細胞的泛素化和自噬調控心肌蛋白的降解。