NGS液體活檢對左/右單側(cè)晚期結(jié)腸癌KRAS基因檢測分析及療效的相關(guān)性研究

晚期結(jié)腸癌是臨床常見的消化道腫瘤，近年來，基因靶向治療為患者帶來更多的獲益。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）的抑制劑聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)化療是晚期結(jié)腸癌的常用治療方式，基因靶向治療需要檢測腫瘤組織中KRAS、BRAF等基因的突變狀態(tài)，KRAS突變是目前臨床上評估EGF單抗治療耐藥的預(yù)測因素[1]。但基因檢測需在腫瘤組織取材，存在操作困難、有創(chuàng)、無法多次取材等缺陷，不能及時有效判斷患者治療后的療效，無法制定個體化治療方案。循環(huán)腫瘤DNA（ct DNA）檢測是一種液體活檢技術(shù)，屬于非侵入性檢查，與傳統(tǒng)組織活檢相比，具有微創(chuàng)、簡便、可重復(fù)等優(yōu)勢，更容易為患者接受。ct DNA是腫瘤細(xì)胞通過凋亡、壞死或者自分泌的形式釋放至外周血的游離DNA，有研究顯示，在結(jié)腸癌中，ct DNA攜帶的腫瘤基因組信息與腫瘤組織具有良好的一致性，甚至可檢出組織中未檢出的突變點，對于結(jié)腸癌基因的檢測具有重大意義[2]。二代測序（next generation sequencing，NGS）是ct DNA基因突變的主要檢測方法，具有較高敏感性。通過ct判斷預(yù)后DNA檢測，可動態(tài)監(jiān)測腫瘤基因信息，評估療效，使治療更加的精準(zhǔn)和個體化。不同部位的結(jié)腸癌在臨床表現(xiàn)、病理學(xué)等方面存在一定的差異，本研究擬探討NGS液體活檢對左/右單側(cè)晚期結(jié)腸驅(qū)動基因檢測分析及治療動態(tài)監(jiān)測與療效的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 對象經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，納入2014年3月—2016年3月在內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院就診的結(jié)腸癌患者，根據(jù)腫瘤位置分為左半結(jié)腸癌組（left colon cancer，LCC組）和右半結(jié)腸癌組（right colon cancer，RCC組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡在18歲以上；初診，經(jīng)腸鏡活檢并行常規(guī)基因檢測，診斷符合左側(cè)晚期結(jié)腸癌或右側(cè)晚期結(jié)腸癌；存在常規(guī)技術(shù)可測量的病灶，即病灶直徑大于10 mm；自愿參與本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在精神疾病或其他原因?qū)е聹贤ㄕ系K；合并有其他系統(tǒng)或器官的惡性疾病。共納入96例，其中LCC組47例，男22例，女25例，平均年齡（57.23±11.19）歲。RCC組49例，男25例，女24例，平均年齡（58.19±12.27）歲。左/右單側(cè)晚期結(jié)腸癌患者性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

1.2 治療方法治療進行之前觀察患者血常規(guī)和生化等指標(biāo)，確定無明顯異常者予以相應(yīng)治療，依據(jù)患者具體病情選擇FOLFOX方案(奧沙利鉑+亞葉酸鈣+5-氟尿嘧啶）、FOLFIRI方案(伊立替康+亞葉酸鈣+5-氟尿嘧啶）或CapeOX方案（奧沙利鉑+卡培他濱）進行化療。在此基礎(chǔ)上加用貝伐珠單抗（Roche Diagnostics GmbH，德國）進行治療，劑量為5～7.5 mg/kg，14 d為1周期，擬治療6個周期。

1.3 療效評價治療前后通過完善彩超、CT或腸鏡檢查。采用實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)[4]對2組臨床療效進行評價：完全緩解（complete response，CR），所有目標(biāo)病灶完全消失；部分緩解（partial response，PR），目標(biāo)病灶大小較基線縮小30%；穩(wěn)定（stable disease，SD），不緩解也不進展；進展（progression disease，PD），目標(biāo)病灶的大小較基線增大20%。疾病控制率（disease control rate，DCR）=（CR+PR+SD）/總例數(shù)×100%，客觀緩解率（objective response rate，ORR）=（CR+PR）/總例數(shù)×100%。通過門診復(fù)診或電話隨訪對2組患者進行隨訪3年，觀察2組患者無疾病進展生存期（progression-free survival，PFS）以及總體生存期（overall survival，OS）。PFS計算方法：從用藥開始至有疾病進展或因任何原因死亡的時間，未出現(xiàn)死亡或者疾病進展的患者，以隨訪結(jié)束時間計算。OS計算方法：開始用藥至任何原因出現(xiàn)的死亡時間，生存或失訪的患者以隨訪結(jié)束時間計算。

1.4 NGS液體活檢另在治療前后空腹?fàn)顟B(tài)采集患者外周靜脈血10 ml，放入含EDTAK3抗凝劑和細(xì)胞防腐劑管中，離心后置于-80 ℃冰箱中保存。采用MagMAXTM cell-free DNA isolation kit提取血漿游離DNA。獲取DNA后使用Ion Ampliseq library kit 2.0構(gòu)建文庫DNA。使用PCR的方法擴增目的片段，DNA兩段加上測序接頭，擴增文庫DNA，磁珠純化。建庫完成后使用核酸測定儀測定文庫DNA濃度。根據(jù)每個樣本測序數(shù)據(jù)需求量和測序深度確定混樣個數(shù)，混合樣本后測定混合后的DNA濃度，根據(jù)公式[稀釋倍數(shù)=熒光計法Qubit濃度（ng/μl）×107/（200×660×2）]將混樣稀釋到200 pmol/μl，取800 pmol的DNA，使用Ion PITMTemplate OT2 Kit v3制備模板。同時將模板載體和文庫DNA置于PCR反應(yīng)體系中，行油包水PCR，富集測序模板提純。PCR熒光定量檢測下限為85拷貝。基因測序儀型號為IlluminaHiSeqX-Ten，初始化測序儀后，測序模板載入測序芯片，上機測試，使用Ion PITM HiQTM Sequencing200 Kit試劑盒測序。測序數(shù)據(jù)通過Torrent source進行分析，分析結(jié)果為突變率≥5%時認(rèn)為突變基因，＜5%時認(rèn)為該基因為野生型。

1.5 觀察指標(biāo)隨訪3年，觀察2組患者的臨床療效，采用NGS液體活檢技術(shù)分析患者ctDNA中KRAS基因突變情況，并分析KRAS基因突變情況與療效的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料采用t檢驗比較，計數(shù)資料采用χ2檢驗，生存情況采用Kaplan-Meier生存函數(shù)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效LCC組平均PFS和OS均顯著較RCC組長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。LCC和RCC患者臨床DCR、ORR差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

2.2 治療前后KRAS基因突變情況經(jīng)ctDNA檢測，LCC和RCC患者治療前的KRAS基因突變率分別為17.02%（8/47）和22.45%（11/49），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而LCC和RCC患者治療后的KRAS基因突變率分別為25.53%（12/47）和55.10%（27/49），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。LCC治療前后的基因突變率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），RCC治療前后的基因突變率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同療效患者治療后的KRAS基因突變率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表2），LCC組中PD患者基因突變率高于PR患者（χ2=4.151，P=0.042）、SD患者（χ2=7.727，P=0.005）；RCC組中PD患者基因突變率高于PR患者（χ2=5.212，P=0.022）、SD患者（χ2=6.578，P=0.010）。

表1 2組結(jié)腸癌患者臨床療效對比

表2 治療后不同療效結(jié)腸癌患者KRAS基因突變情況[例（%）]

2.3 KRAS基因突變與療效的相關(guān)性經(jīng)Kaplan-Meier生存函數(shù)分析后發(fā)現(xiàn)，所有患者整體平均生存期（27.67±1.12）個月，非基因突變患者的平均生存期（31.15±1.13）個月，基因突變組患者的平均生存期（21.32±1.68）個月，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。

圖1 KRAS基因突變與非突變患者生存函數(shù)

3 討論

在以往較長一段時間，臨床上并未區(qū)分LCC和RCC的治療方法，普遍視為同一種疾病，最早是由Bufill等[4]在1990年開始提出種病變是不同疾病，二者胚胎起源不同，隨后在大量的研究病例上發(fā)現(xiàn)，LCC和RCC的流行病學(xué)、生物學(xué)特征、臨床病理、治療療效均存在差異[5-7]，這些LCC和RCC的差異逐漸引起了科研與臨床工作者的重視。研究認(rèn)為其出現(xiàn)各種差異的主要原因可能與KRAS等癌癥相關(guān)基因的差異性表達有關(guān)[8]，對LCC和RCC區(qū)分治療方法可能更加具有針對性，可能取得更好的療效。

KRAS是一種與肺癌、大腸癌等癌癥密切相關(guān)的基因，在多種腫瘤組織中均有表達，與腫瘤的分期、分化程度等具有一定相關(guān)性，有研究顯示，其ctDNA的基因組信息與腫瘤組織中的基因組信息具有高度的一致性，可作為臨床監(jiān)測KRAS基因突變的有力指標(biāo)[2]。KRAS基因是VEGF和EGF的一種重要的下游信號靶點，當(dāng)臨床使用貝伐珠單抗等靶向藥物時，該類藥物可抑制VEGF和EGF，信號無法傳遞至KRAS，KRAS無法正常激活，導(dǎo)致下游信號傳導(dǎo)通路受阻，從而達到抑制腫瘤的目的[9]。而當(dāng)KRAS基因突變時，可能無需EGF和VEGF的上游信號傳導(dǎo)進行激活，可自行激活并使EGF和VEGF相關(guān)的促癌信號通路異常激活，導(dǎo)致靶向藥物藥效下降，因此KRAS基因的突變率可能有助于判斷患者對靶向藥物的療效與耐藥[10]。本研究觀察LCC與RCC治療療效顯示，LCC組平均PFS和OS均顯著較RCC組長，LCC和RCC患者臨床DCR分別為76.60%和53.06%，2組OR分別為34.04%和16.33%。提示一線化療聯(lián)合貝伐珠單抗的同等治療方式下，LCC臨床效果顯著優(yōu)于RCC。其可能的原因在于，與LCC比較，RCC患者一般病理分期較高，分化程度更低，且KRAS基因突變在右半結(jié)腸癌中更為常見[11-12]。而治療前后的基因突變率比較同樣顯示，RCC患者在治療后KRAS基因突變率顯著增加。

本研究采用二代測序法檢測結(jié)腸癌患者ctDNA中KRAS基因突變情況，分析不同療效患者的基因突變情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LCC組的KRAS基因突變率（25.53%）顯著低于RCC組（55.10%），與李秀博等[13]研究結(jié)果一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，不同療效患者治療后的KRAS基因突變率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，LCC組中PD患者基因突變率高于PR、SD患者；RCC組中PD患者基因突變率高于PR、SD患者，提示KRAS基因突變率越高，可能臨床療效越差，而結(jié)合RCC的KRAS基因高突變率，可推斷RCC由于KRAS基因突變率高，因而療效較差。通過隨訪發(fā)現(xiàn)，非KRAS基因突變的患者生存率顯著高于KRAS基因突變的患者，而彭健等[14-15]的研究同樣證實，KRAS基因野生型的左半結(jié)腸癌患者應(yīng)用靶向藥物治療，預(yù)后好于右半結(jié)腸癌。這提示KRAS基因突變的監(jiān)測對靶向藥物治療后的預(yù)后的判斷具有一定幫助[16]。

綜上所述，一線化療聯(lián)合貝伐珠單抗治療LCC的療效優(yōu)于RCC，其原因可能是RCC中KRAS基因突變率較高。而采用NGS液體活檢技術(shù)監(jiān)測結(jié)腸癌KRAS基因突變情況能夠較好得判斷患者療效以及預(yù)后。