三種檢測技術鑒別結核分枝桿菌復合群與非結核分枝桿菌的效能評價

易俊莉 楊新宇 張潔 田麗麗 丁北川 武文清

非結核分枝桿菌病與結核病臨床表現相似，如未能及時準確鑒定極易造成誤診，且非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)大多對常見的抗結核藥品耐藥，只采用常規抗結核藥品進行治療療效大多不理想。因此，需要操作簡便、快速、可靠的區分結核分枝桿菌復合群(MTBC)與NTM的檢測方法。為此，筆者比較不同原理的3種方法[即：對硝基苯甲酸/噻吩-2-羧酸肼(PNB/TCH)生長試驗法、結核分枝桿菌抗原(MPB64)檢測法、PCR-熒光探針法]對MTBC和NTM的鑒定結果，分析其臨床應用價值。

資料和方法

一、菌株來源

11株標準菌株包括MTB標準株H37Rv及10株 NTM標準株(堪薩斯分枝桿菌、戈登分枝桿菌、胞內分枝桿菌、鳥分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、偶然分枝桿菌)均來源于國家結核病參比實驗室。238株臨床分離株為北京結核病控制研究所2019年1—12月門診患者培養陽性凍存菌株，經涂片抗酸染色均為陽性。

二、檢驗方法

1.儀器與試劑：中性羅氏培養基及PNB/TCH培養基由河南賽諾特生物技術有限公司提供。結核分枝桿菌抗原(MPB64)檢測試劑盒由杭州創新生物檢控技術有限公司提供。PCR-熒光探針法使用Roche LightCycler480儀，試劑盒由成都博奧晶芯生物科技有限公司提供。微陣列基因芯片試劑盒、核酸提取儀、芯片雜交儀、芯片掃描儀由北京博奧生物有限公司提供。

2.菌株復活：從菌株凍存管中取0.1 ml菌液接種在中性羅氏培養基中，37 ℃孵育2～4周，每周觀察生長情況，直至長出可視菌落。

3.PNB/TCH生長試驗：按照《結核病實驗室檢驗規程》[1]進行。取中性羅氏培養基中復活的單個菌落加入無菌生理鹽水制成1 mg/ml菌液。將稀釋成10-2mg/ml的菌液各取0.1 ml分別接種于中性羅氏培養基與PNB/TCH培養基上，37 ℃孵育4周，觀察菌落生長情況。PNB/TCH生長者判定為NTM，PNB未生長TCH生長判定為MTBC，中性羅氏培養基無生長時需重新檢測。

4.MPB64檢測法：在試管中加入0.2 ml生理鹽水及中性羅氏培養基中復活的單個菌落，加蓋后用渦旋混合器充分混合制成待測樣本。將100 μl樣本滴入檢測板的加樣孔內，反應15 min，觀察結果。陽性：檢測線(T)及質控線(C)都出現紫紅色條帶。陰性：檢測線(T)處沒有出現紫紅色條帶，只有質控線(C)處出現紫紅色條帶。如質控線沒有顯示條帶時使用其他檢測板重新檢測。陽性結果判定為MTBC，陰性結果判定為NTM。

5.PCR-熒光探針法：取中性羅氏培養基中復活的單個菌落及50 μl核酸提取液加入核酸提取管中，放入核酸提取儀震蕩5 min，95 ℃水浴5 min，3000×g離心1 min。取2 μl核酸樣本加入18 μl擴增反應液管后放入實時熒光定量PCR儀。設置PCR擴增程序：37 ℃ 5 min、94 ℃ 3 min后，94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，40個循環，50 ℃ 10 s。檢測通道同時選擇羧基熒光素(FAN)和六氯熒光素(HEX)通道，熒光采集點選擇60 ℃ 30 s。樣本擴增曲線呈S型，且循環閾值(Ct值)<40判定為陽性，擴增曲線不呈S型或Ct值≥40(或無任何數值)判定為陰性。FAM通道陽性，HEX通道陽性或陰性，判定為MTBC。FAM通陰性，HEX通道陽性，判定為NTM。FAM通道陰性，HEX通道陰性判定為分枝桿菌核酸檢測陰性。

6.微陣列基因芯片檢測：核酸提取方法同PCR-熒光探針法。將提取的2 μl模版DNA加入至18 μl反應體系中，按試劑盒說明書進行PCR擴增。取6 μl PCR擴增產物、9 μl雜交緩沖液制成雜交反應混合物，從蓋片的加樣孔加入，50 ℃雜交2 h。雜交結束后用十二烷基硫酸鈉洗液和檸檬酸鈉洗液沖洗干凈，用晶芯MTB檢測芯片系統進行結果判讀。

三、統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行分析。計數資料以“率(%)”表示。以微陣列基因芯片鑒定結果為參照，計算PNB/TCH生長試驗法、MPB64檢測法、PCR-熒光探針法對MTBC的檢測效能，計算公式：敏感度(%)=真陽性株數/(真陽性株數+假陰性株數)×100%；特異度(%)=真陰性株數/(真陰性株數+假陽性株數)×100%；符合率(%)=(真陽性株數+真陰性株數)/總株數×100%；陽性預測值(%)=真陽性株數/(真陽性株數+假陽性株數)×100%；陰性預測值(%)=真陰性株數/(真陰性株數+假陰性株數)×100%。采用Kappa值進行一致性檢驗，Kappa值≥0.75時表示一致性較好。

結 果

一、標準菌株檢測結果

10株NTM標準菌株及MTB標準株經PNB/TCH生長試驗法、MPB64檢測法、PCR-熒光探針法均正確判定。238株臨床分離株中，PNB/TCH生長試驗法檢出207株(87.0%)MTBC、31株(13.0%)NTM；MPB64檢測法檢出203株(85.3%)MTBC，35株(14.7%)NTM；PCR-熒光探針法檢出206株(86.6%)MTBC，32株(13.4%)NTM。有4株菌應用PNB/TCH生長試驗法、MPB64檢測法、PCR-熒光探針法檢測結果不一致，其中3株MPB64檢測結果為NTM菌株，PNB/TCH生長試驗和PCR-熒光探針法檢測結果為MTBC，后經微陣列基因芯片鑒定確認為MTB；1株菌PNB/TCH生長試驗法檢測結果為MTBC，MPB64檢測和PCR-熒光探針法檢測結果為NTM，后經微陣列基因芯片鑒定確認為堪薩斯分枝桿菌。

二、檢測效能分析

以微陣列基因芯片法鑒定結果為參照標準，PNB/TCH生長試驗法檢測MTBC的敏感度為100.0%(206/206)、特異度為96.9%(31/32)；MPB64檢測法檢測MTBC的敏感度為98.5%(203/206)、特異度為100.0%(32/32)；PCR-熒光探針法檢測MTBC的敏感度為100.0%(206/206)、特異度為100.0%(32/32)；Kappa值分別為0.98、0.95、1.00(表1)。

三、方法可實施性分析

PNB/TCH生長試驗法、MPB64檢測法、PCR-熒光探針法檢測周期分別為28 d、0.5 h、0.5 d，檢測平均成本分別為20、40、60元。PNB/TCH生長試驗法和MPB64檢測法需要得到培養物才能進行檢測。PCR-熒光探針法需要實驗室及操作人員具有專業的核酸檢測能力(表2)。

表1 以微陣列基因芯片法為參照標準評價3種檢驗方法檢測MTBC的效能

表2 PNB/TCH生長試驗法、MPB64檢測法、PCR-熒光探針法可實施性比較

討 論

本研究以微陣列基因芯片法鑒定結果為參照標準，分析比較了三種不同原理的MTBC和NTM鑒定方法的檢測效能及可實施性。PNB/TCH生長試驗法是最傳統的鑒定MTBC的方法，其是利用MTBC在含有PNB培養基中生長受到抑制，大多數NTM對一定濃度的PNB有耐藥性的原理，從而鑒別MTBC與NTM。MPB64檢測法檢測對象為培養物中的結核分枝桿菌抗原MPB64(又稱MPT64)，是MTBC分泌的一種特異性分泌蛋白，而NTM不分泌。PCR-熒光探針法采用雙重PCR技術和Taqman探針技術相結合的原理，對樣本中提取的分枝桿菌核酸進行定性檢測。

本次研究中，PNB/TCH生長試驗法檢測MTBC 的敏感度為100.0%，特異度為96.9%。其中，1株菌PNB/TCH生長試驗法檢測結果為MTBC，MPB64檢測法和PCR-熒光探針法檢測結果為NTM，經微陣列基因芯片法最終菌種鑒定為堪薩斯分枝桿菌，說明PNB/TCH生長試驗法作為MTBC與NTM鑒別試驗存在局限性，部分NTM可能被錯誤歸類為MTBC，與李國利等[2]的報道一致。吳龍章等[3]分析認為，需要光學照射才能產生色素的光產色性分枝桿菌菌群(如堪薩斯分枝桿菌)在實驗室中未經光學照射易誤判為MTBC，從而導致檢驗結果出現錯誤。當比例法藥敏試驗顯示多種藥品耐藥而PNB顯示敏感，且對照管生長的菌落為細小菌落或產色時，應高度懷疑為NTM，為避免結果差錯，建議采用其他方法進一步驗證。

MPB64檢測法檢測MTBC的敏感度為98.5%，特異度為100.0%。其中，有3株假陰性結果，即MPB64檢測法檢測結果為NTM，PNB/TCH生長試驗法、PCR-熒光探針法檢測結果為MTBC，經微陣列基因芯片法最終菌種鑒定為MTBC，該現象此前也有報道。分析其主要原因，可能為MTB中的MPB64編碼基因突變，如63 bp缺失，造成出現檢測假陰性結果[4-7]。MPB64檢測法除了可以利用固體培養基上的菌落進行檢測，也可以采用抗酸桿菌培養物的懸濁液或者培養液直接作為樣本使用。因此，適用于BACTEC MIGIT 960培養陽性后藥物敏感性試驗前的菌種初步鑒定，可縮短檢測周期。但對生長指數較低的樣本，應適當延長培養時間，以避免假陰性產生[8-9]。液體培養法MTB涂片鏡檢多呈索狀排列，NTM多呈團塊狀排列或散在分布，因此，當MPB64檢測法檢測結果與涂片鏡檢形態結果不一致時，建議采用其他方法進一步確認。

PCR-熒光探針法具有較高的敏感度和特異度。《WS 288—2017肺結核診斷》[10]也已將分枝桿菌核酸檢測納入結核病病原學檢查范疇。核酸擴增法可以利用臨床痰標本直接進行檢測，作為痰涂片和培養的補充，對結核病病原學快速檢測具有重要的臨床應用價值[11]。同時，因無需使用陽性培養物進行檢測，可大幅縮短檢測周期，為患者早期診斷和制定化療方案提供依據。

在各實驗室技術可實施性方面，PCR-熒光探針法檢測耗時短，總檢測時間僅需要0.5 d，但操作較為復雜，需要實驗室及操作人員具有專業的核酸檢測能力，且前期設備儀器投入較大，造成檢測成本相對較高,在基層實驗室推廣使用尚需時日。MPB64檢測法操作更為簡便，只需在生物安全柜內將樣本滴入加樣孔后15 min即可觀察結果，總檢測時間不超過30 min。同時，該方法對實驗人員和實驗輔助設備要求相對不高，試劑盒可常溫保存，費用合理，更適用于標本量較多且檢測條件有限的基層實驗室。PNB/TCH生長試驗法具有操作簡單、費用低的優勢，但培養判定所需時間較長(28 d)，在快速鑒別診斷中并無優勢。

綜上所述，三種方法均可用于MTBC與NTM的鑒定，各具優勢。PCR-熒光探針法敏感度和特異度高，檢測結果較其他兩種方法更為準確可靠，適合具有核酸檢測能力的實驗室使用。MPB64檢測法操作簡便、快速、價格低廉，更適合標本量大且檢測能力有限的基層實驗室進行初步鑒定使用。