TgAb干擾血清Tg檢測的相關因素研究進展

程少浩，蘇艷軍，程若川

昆明醫科大學第一附屬醫院，昆明650031

甲狀腺球蛋白（Tg）作為一種甲狀腺濾泡上皮細胞分泌的特異性蛋白（660 kDa），通常儲存在甲狀腺濾泡中，在正常甲狀腺濾泡細胞或分化型甲狀腺癌（DTC）細胞中均可分泌。甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）屬于G 類免疫球蛋白，主要來源于浸潤甲狀腺組織的淋巴細胞，常見于自身免疫性甲狀腺疾病。Tg 作為DTC 患者甲狀腺全切或近全切除術后（不論是否行131I治療）常規而有效的監測指標，易受到TgAb 的干擾；其次，DTC患者血清TgAb陽性率達30%，TgAb可干擾血清Tg 檢測導致Tg 假陰性，使得Tg 不能作為TgAb 陽性DTC 患者隨訪監測腫瘤復發的血清標志物。本研究對TgAb 干擾血清Tg 檢測的相關因素作一綜述，以期提高Tg 檢測的準確性，為臨床醫師對TgAb陽性患者的管理提供參考。

1 血清TgAb檢測方法的干擾

1.1 TgAb 的異質性 TgAb 的異質性可導致同一樣本用不同方法測定的TgAb 相差100 倍，當血清TgAb 較低（1～2 IU/mL）時部分血清表現出這種檢測結果的差異性，而TgAb 值很高（＞1 000 IU/mL）的血清則差異性較小［1-2］。SPENCER 等［1］對 785 例患者用4 種不同免疫測定法檢測血清TgAb，發現用不同方法檢測同一樣本的TgAb值不一致，反映了血清TgAb的異質性，認為是由于循環TgAb對Tg抗原、檢測試劑和各種方法使用標準的特異性不同而造成的。PICKETT 等［3］也發現了相似的觀點，認為TgAb不是單一的分子實體，而是免疫球蛋白混合物，具有與Tg 相互作用的能力。對于測定結果的不一致，在排除了研究對象特異性、Tg 干擾程度以及抗體陽性或陰性樣品的特定臨界值、TgAb 敏感性等因素外，多考慮與內源性TgAb 具有不同表位有關。目前為止沒有一項免疫測定法可以檢測出所有的TgAb，大多數的免疫測定法只是檢測出了TgAb 的一個子集［1，3］，而其余 TgAb 子集即使沒有被檢測到，實際上也能干擾Tg的測定。

1.2 TgAb的臨界值

1.2.1 TgAb 臨界值的分類 目前臨床常采用的血清TgAb 截點值包括檢測限（LoD）≥0.07 U/mL、功能敏感性（FS）≥0.31 U/mL、制造商臨界值（MCO）≥4.11 U/mL、機構臨界值（ICO）≥10 U/mL。

1.2.2 TgAb 臨界值選取的意義 TgAb 臨界值的選取是一個重要而又有爭議的問題。根據截點值選取的不同，有研究發現針對不同的TgAb 臨界值，所測得的TgAb 狀態（陽性或陰性）不同［4-5］。SPENCER等［2］的研究中，當用MCO 作為臨界值用于確定TgAb的存在時，許多顯示干擾的樣本被錯誤地歸類為TgAb 陰性，并且在某些情況下，這些錯誤分類的樣本對 Tg 測定顯示出顯著干擾。DEKKER 等［6］對 230例患者進行研究發現，在應用LoD＞0.07 U/mL及FS≥0.31 U/mL 分別作為TgAb 陽性的臨界值時，所有患者被歸類為 TgAb 陽性；而采用 MCO≥4.11 U/mL 時有23.9%的患者為TgAb 陽性，采用ICO≥10 U/mL時僅14.8%患者為TgAb 陽性；該研究認為LoD 和FS 作為定義DTC 患者放射性碘消融治療期間TgAb陽性的臨界水平，在臨床實踐中并不實用，因為其對Tg 測定值存在嚴重干擾，使Tg 不能作為腫瘤標記物。由于幾乎所有患者的TgAb高于這些臨界值，在臨床實踐中使用MCO 或ICO 作為臨界值似乎更合理。與此同時，基于MCO 或ICO 為臨界值定義的TgAb 陽性患者與TgAb 陰性患者相比，在腫瘤特征和危險性方面沒有差異，這意味著TgAb陽性不應被視為單獨的危險因素，也不應該被視為危險分層的獨立因素。但是目前為止，尚無關于TgAb陽性定義的臨床共識，因為這些研究都是基于所在實驗室定義的TgAb臨界值來進行的。

2 不同TgAb檢測方法間的干擾

2.1 Tg 恢復實驗的干擾 目前，TgAb 的檢測方法主要是通過Tg 恢復實驗間接測定TgAb 和免疫測定法。Tg 恢復實驗是將外源性Tg 添加到等分量的血清試劑中，經免疫測定法測定添加前后的Tg 值，添加后與添加前測定的Tg 值比值大于80%則表示無TgAb 干擾［7］。在恢復實驗的過程中必須保證添加的外源性Tg 和內源性Tg 在免疫學上表現一致；其次，對于添加的Tg 類型和數量也要嚴格控制，因為Tg 具有表位特異性，所以正常甲狀腺組織、切除后殘留甲狀腺組織以及腫瘤細胞分泌的Tg 可表現出不同的檢測結果；最后，免疫測定法優先測定游離Tg，對于添加外源性Tg 數量過多時，TgAb 結合位點趨于飽和，容易造成游離的外源性Tg 過量，從而使添加前后Tg比值過高，相對于等量外源性Tg來說具有顯著的TgAb 干擾作用［7-8］。雖然Tg恢復實驗操作簡單，但其判斷TgAb 干擾的可靠性較差，現已很少應用［3，9］。

2.2 TgAb 免疫測定法的誤差 對于TgAb 免疫測定法，由于各個實驗室有自己的參考標準，即使大部分的TgAb 檢測試劑盒都是根據國際IRP-65/93 參考制劑作為一級標準品進行校準的，但也有研究顯示不同的TgAb測定方法間差異較大，使用不同方法測定同一樣本中的TgAb存在100倍誤差［1］。最近的一項研究評價了11 種自動化免疫檢測方法對TgAb檢測的一致性，發現檢測結果的第25百分位數相差48 倍（0.24 IU/mLvs11.5 IU/mL），第75 百分位數相差30 倍（0.59 IU/mLvs17.97 IU/mL），表明不同方法測定的TgAb 結果差異較大［10］。造成這種不一致的原因可能與Tg 特異性、檢測試劑差異、TgAb 敏感性和異質性以及TgAb臨界值選取差異等有關，這種方法間的差異極易使血清Tg 檢測受到影響，造成DTC 術后管理不當。針對這種差異，臨床醫生在DTC 患者的隨訪中必須使用相同方法來監測TgAb水平，另一方面，實驗室必須及時通知臨床醫生TgAb方法的改變，以便重新定義基線。

3 血清Tg檢測方法的干擾

Tg分析的功能敏感性定義為在6～12個月內使用至少兩個不同批次的試劑和兩臺儀器校準，測量變異系數為20%的人血清中最低Tg 濃度［13］。對于TgAb 陰性患者的血清Tg 來說，造成Tg 測量誤差的原因主要是Tg 的功能敏感性在不同測定方法間的差異以及Tg 的特異性。目前第一代Tg 免疫測定法功能敏感性為0.5～1.0 mg/L，第二代Tg 免疫測定法功能敏感性≤0.1 mg/L，兩者相差了至少 5 倍［14］。由于試劑批次和校準器、儀器因素和其他變量的影響，以及DTC 患者血清Tg監測的臨床周期較長（6～12 個月），均會導致檢測精確度下降，對患者的管理產生負面影響，所以建議實驗室使用TgAb陰性患者血清校準該檢測的功能靈敏性［15-16］。

不同的Tg 檢測方法均需經過BCR?457 進行標準化，在此之前不同方法間的Tg 檢測結果差異高達60%［15］。BCR?457 在 Tg 測定標準化中的使用大大降低了方法間的變異性，但是當采用不同方法測定同一樣品時，測得的Tg 水平仍然具有顯著差異［12］。這些方法間的差異反映了Tg 的特異性，使得不同的檢測試劑和檢測方法可檢測出不同的Tg 亞型。而對于腫瘤來源的Tg，方法間的不一致反映在不同方法報告值之間的異常比率上，這表明當Tg 結構異常時不同的表位可能被掩蓋或暴露。

4 TgAb陽性對Tg檢測的干擾

TgAb 以定性、定量和方法依賴的方式干擾Tg測定，采用RIA 和IMA 兩種方法檢測同一血清樣本時，Tg IMA 值是降低的，而Tg RIA 值升高或者降低取決于患者TgAb和試劑之間的相互作用。

RIA 是一種非自動化、非同位素且需要較長時間才能達到最高功能敏感性的Tg 分析方法，且在檢測過程中可以導致Tg 的假陽性或假陰性。IMA 是一種實驗周期短、自動化、功能敏感性高（0.05～1.0 μg/L）的 Tg 測定法，相對于 RIA 來說，IMA 對TgAb 干擾的抵抗力較差，即便是低濃度的TgAb 也會引起Tg 降低甚至檢測不到，其原因可能是TgAb結合Tg 時掩蓋了單克隆抗體試劑識別所需的表位［5，8］。目前最新的檢測方法是 LC-MS/MS，該方法利用胰蛋白酶切割包括TgAb 和其他抗體在內的一切蛋白質，以降低 TgAb 對血清 Tg 的干擾［12］。NET?ZEL 等［12］研究比較了 3 種不同的 Tg 檢測方法，結果發現對于大多數TgAb 陽性的血清樣品來說，LCMS/MS 檢測的 Tg 值明顯高于 IMA 和 RIA；在 IMA 無法檢測到Tg 的情況下，LC-MS/MS 可將檢測Tg 的效率提高22%；但是，LC-MS/MS 檢測TgAb 陽性患者復發或殘留甲狀腺癌的臨床敏感性卻低于功能敏感性≤0.1 mg/L 的IMA（42%vs55%），只有當LC-MS/MS 和IMA 使用相同的功能敏感性（0.5 mg/L）時，LC-MS/MS 檢測的敏感性略高于IMA，具有相當的特異性。AZMAT 等［17］也發現了相似的敏感性結果。盡管LC-MS/MS的檢測效率較高，但價格昂貴，且無法完全避免TgAb 對血清Tg的干擾，因此LC-MS/MS在臨床上的實用性問題仍有待解決［18］。

5 TgAb 對頸部淋巴結細針穿刺（FNA）洗脫液中Tg（FNA-Tg）的干擾

FNA-Tg 檢測在鑒別頸部DTC 的復發及轉移方面的作用已經得到了證實［19-20］，然而在這些洗脫液中也存在TgAb。目前TgAb對血清Tg的干擾是眾所周知的，而TgAb 是否會干擾FNA-Tg 的評估也備受學者關注。

5.1 TgAb陰性對頸部淋巴結FNA-Tg的干擾 TgAb陰性時不會對頸部淋巴結FNA-Tg 產生干擾。JO等［21］對 273 例 DTC 患者的 370 枚可疑頸部淋巴結進行研究，發現在惡性淋巴結中，TgAb 陰性組單獨采用 FNA-Tg 與 FNA-TgAb 聯合 FNA-Tg 的診斷效果無明顯差異；此外，相對于TgAb 陽性組的FNA-Tg（2.5～6.0 ng/mL），TgAb 陰性組在FNA-Tg 為6.0～8.5 ng/mL 時的診斷效能最高。DUVALMA 等［22］對119例可疑的頸部淋巴結轉移DTC患者進行評估，發現65例淋巴結轉移患者中TgAb陽性和陰性者FNA-Tg無顯著差異，提示TgAb水平對FNA-Tg無明顯干擾，其原因可能與細胞內Tg不與循環中的TgAb接觸有關。

5.2 TgAb 陽性對頸部淋巴結FNA-Tg 的干擾 由于臨床數據的缺乏，目前關于TgAb陽性對頸部淋巴結 FNA-Tg 的干擾尚存在爭議［21，23-24］。一項回顧性研究發現，TgAb 陽性組和TgAb 陰性組惡性淋巴結內FNA-Tg 水平無明顯差異，提示TgAb 陽性不會影響 FNA-Tg［24］。同樣，DUVALMA 等［22］也發現了相似的結果。此外，轉移性淋巴結中FNA-Tg水平遠高于FNA-TgAb 水平，說明轉移性淋巴結中Tg 可以克服由于飽和的TgAb結合位點而引起的干擾，并且洗脫液中稀釋的TgAb 可以導致頸部淋巴結內TgAb缺失或減少［26］。

但 SHIN 等［23］研究發現，轉移性淋巴結中 TgAb陽性組的FNA-Tg 值明顯低于TgAb 陰性組，且FNATg 與血清TgAb 之間存在顯著相互作用。此外，在1例份TgAb 陽性的轉移性頸部淋巴結中未檢出FNA-Tg，但病理上Tg染色較強，提示血清TgAb水平過高干擾了FNA-Tg 測定，從而導致假陰性FNA-Tg值，且高濃度TgAb 也與FNA-Tg 敏感性和陰性預測值顯著降低相關。同樣，JO 等［21］研究發現，良性淋巴結中TgAb 陽性組和TgAb 陰性組的FNA-Tg 無顯著差異，而在轉移淋巴結中TgAb 陽性組FNA-Tg 水平明顯低于TgAb陰性組；且在TgAb陽性患者中，無論是否聯合FNAC，FNA-Tg的診斷準確率都比較低。因此，仍然需要更多的前瞻性研究來評估TgAb陽性對頸部淋巴結FNA-Tg的干擾。

6 FNA-TgAb對FNA-Tg的干擾

BOI 等［26］的一項小樣本研究同時測定了穿刺洗脫液中的TgAb 和Tg，結果發現有25%的患者FNATgAb陽性，濃度分別為722、162 IU/mL；對于穿刺液中存在TgAb，可能的原因為淋巴細胞的分泌以及穿刺對血液的污染。此外，該研究在穿刺液中檢測到TgAb 的2 例患者FNA-Tg 水平明顯降低，提示穿刺洗脫液中的TgAb 實際上可能干擾了Tg 的檢測。但是，這種干擾似乎對TgAb 陽性患者的FNA-Tg 水平影響很小，因為FNA-Tg 水平均遠高于臨界值水平，其原因可能是高水平FNA-Tg 患者中高濃度的Tg 能夠飽和TgAb的結合位點。

綜上所述，血清TgAb 和Tg 是DTC 患者隨訪中的兩個重要血清學指標，TgAb 可對DTC 患者Tg 的測定產生干擾，在TgAb 陽性時導致Tg IMA 值降低，而Tg RIA 值升高或者降低導致Tg 不能作為DTC 隨訪的可靠腫瘤標記物；FNA-TgAb 陽性可干擾FNATg 值，導致 FNA-Tg 下降，使得 FNA-Tg 在預測頸部淋巴結轉移方面效果不佳；而穿刺洗脫液中的TgAb雖可降低FNA-Tg，但這種干擾似乎對TgAb 陽性患者的FNA-Tg影響很小，需要更多的前瞻性研究來探討。盡管已知TgAb 會干擾Tg 的檢測結果，但目前尚無TgAb 陽性的共識性標準，也未能解決關于TgAb干擾Tg的臨界水平等相關問題。因此，DTC患者的隨訪除結合常規的隨訪指標外，還應進行抗TgAb 干擾的Tg 檢測實驗，并開展新型的預后指標，如循環上皮細胞、分子標記、DNA測序等。