間充質干細胞外泌體修復脊髓損傷作用機制的研究進展

馬麟，張曉勃，趙光海，鞏朝陽，張海鴻

蘭州大學第二醫院，蘭州 730030

脊髓損傷（SCI）是一種破壞性神經退行性疾病，臨床上目前缺乏對該病有效的治療方法，而納米技術和再生醫學策略為新型療法的開發帶來了希望。干細胞可通過替代丟失或受損的細胞為神經元提供營養支持，改善脊髓的微環境，從而促進受損軸突再生，加快SCI修復［1］。間充質干細胞（MSCs）可來自骨髓、脂肪、臍帶血和胎盤等多種組織，具有歸巢、增殖、分化、分泌和免疫調節的功能，是動物研究和人類臨床試驗中最常用的干細胞［2］。外泌體是釋放到細胞膜外的納米級囊泡，含有大量復雜分子如蛋白質、脂類和各種核酸，而這些分子的特性與它們的來源細胞有關［3］。MSCs外泌體（MSCs-Exo）的生物學功能與MSCs相似，但MSCs-Exo更穩定，不會引發機體免疫排斥反應；其具有易分離的特點，故可用于將遺傳物質或藥物轉運至靶細胞；并且尺寸相對較小，故能滲透血腦屏障到達中樞神經系統損傷部位［4-5］。因此，MSCs-Exo是無細胞治療的合適選擇。多項研究顯示，MSCs-Exo在SCI修復中有巨大潛力。本文就MSCs-Exo修復SCI的作用機制綜述如下。

1 MSCs-Exo通過促進血管生成修復SCI

血管生成是SCI修復的關鍵，局部血管丟失與血腦屏障損傷引起的破壞可導致缺血和炎癥反應，從而引發脊髓神經組織的綜合性損傷［6］。血管內皮細胞是血管壁的重要組成部分，MSCs-Exo可以上調人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）中與血管生成相關的關鍵基因表達；而血管內皮生長因子（VEGF）在MSCs-Exo介導的HUVECs增殖和遷移中起關鍵作用［7］。源自誘導多能干細胞的MSCs-Exo可直接被HUVECs吸收，激活VEGF、血管生成素和轉化生長因子β1（TGF-β1）的表達，從而促進HUVECs的遷移、增殖和血管形成［8］。SCI后的脊髓組織通常處于缺氧狀態，故低氧處理的MSCs-Exo與正常MSCs-Exo相比更易被HUVECs吸收，并可通過激活蛋白激酶A信號通路增加HUVECs中VEGF的表達［9］。

此外，MSCs-Exo可釋放內源性miRNA來促進血管生成并通過轉移外源性miRNA對HUVECs的靶基因進行調控。人脂肪來源的MSCs-Exo富含miR-125a，HUVECs可通過攝取miR-125a來抑制血管生成抑制劑delta樣配體4（Dll-4）表達，并調節內皮細胞的血管生成［10］。HUANG等［11］研究顯示，MSCs-Exo可通過抑制miR-126直接靶向HUVECs中磷酸肌醇3激酶調節亞基2和sprouty相關EVH1域蛋白1的表達發揮促血管生成作用。

2 MSCs-Exo通過促進軸突生長修復SCI

損傷軸突的再生和損傷部位軸突的生長對SCI后脊髓功能的恢復具有重要意義，MSCs-Exo可通過誘導軸突生長和減少硫酸軟骨素蛋白聚糖（CSPG）的產生來緩解神經傳導異常。ZHANG等［12］的體外研究顯示，用MSCs-Exo培養24 h和48 h的皮質神經元與對照組神經元相比，遠端軸突長度分別增加了33%和24%，提示MSCs-Exo可在體外促進皮質神經元的軸突生長。近期，有學者認為抑制軸突再生的主要機制是CSPG的產生［13］。在尾靜脈注射MSCs-Exo的SCI大鼠中，CSPG在SCI區的沉積明顯減少，軸突損傷再生率比未經治療的SCI大鼠高出80%。此外，攜帶介導軸突生長特異性miRNA的MSCs-Exo可比不攜帶miRNA的MSCs-Exo更好地促進軸突生長［14］。研究發現，神經絲蛋白200（NF200）、生長相關蛋白43（GAP-43）和神經膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）是參與神經元再生的三個重要蛋白。在大鼠SCI模型中，尾靜脈注射miR-133b修飾的MSCs-Exo可增加GAP-43和神經絲的表達，有助于軸突再生［15］。注射攜帶miR-29b的MSCs-Exo也可減輕SCI大鼠脊髓組織的病理學損傷，增加NF200、GAP-43和GFAP等表達，促進神經元再生［16］。因此，MSCs-Exo可以作為一種新的生物活性物質治療中樞神經系統疾病，同時它也是miRNA和小干擾RNA的有效載體。

3 MSCs-Exo通過調節炎癥反應修復SCI

臨床發現，SCI引起的神經性疼痛通常難以治療。SHIUE等［17］使用MSCs-Exo作為無細胞療法治療大鼠神經損傷所致的疼痛，發現MSCs-Exo可抑制神經結扎側L5、L6背根神經節中TNF-α和白細胞介素1β（IL-1β）的表達，同時提高IL-10、腦源性神經營養因子和神經膠質細胞源性神經營養因子的表達，提示其具有抗炎和增加神經營養的能力。SUN等［18］研究顯示，人臍帶來源的MSCs-Exo可有效觸發骨髓衍生的巨噬細胞（BMDM）從促炎表型（M1型）向抗炎表型（M2型）轉化。MSCs-Exo可通過下調炎癥細胞因子改善SCI后的功能恢復，并通過減輕損傷部位的炎癥來促進脊髓損傷的愈合。因此，鞘內注射MSCs-Exo可能是治療神經損傷所致疼痛的一種有效方式。

SCI可激活經典和替代補體途徑，這些途徑的激活可能加重炎癥過程和對脊髓的繼發性損傷。MSCs-Exo可作為互補抑制劑減少互補mRNA的表達，同時抑制核轉錄因子κB（NF-κB）信號通路并促進SCI修復。SCI后補體表達增加，但在尾靜脈注射了MSCs-Exo的SCI大鼠血清中，補體C1q、C3、C4b、C6、C5及補體因子H（CFH）和補體因子P（CFP）的mRNA水平均低于未注射的SCI大鼠。這提示MSCs-Exo通過減少互補mRNA表達減輕SCI，用MSCs-Exo靶向關鍵補體可能是緩解SCI的有效方法［19］。SCI引起的繼發性炎癥反應受NF-κB通路調節，抑制NFκB途徑可有效減輕炎癥反應并促進SCI后的功能恢復，而補體C1q、C3與NF-κB信號傳導途徑有關［20］。此外，MSCs-Exo可以下調磷酸化型NF-κB（p-NFκB）和磷酸化型核轉錄因子κB抑制蛋白α（p-IKBα）水平，并抑制SCI誘導的NF-κB亞基表達［19］。

4 MSCs-Exo通過調節免疫反應修復SCI

巨噬細胞及小膠質細胞具有高度可塑性，M1型、M2型巨噬細胞及小膠質細胞可同時存在于SCI部位，而M1與M2型的比例對SCI的修復非常重要。研究發現，MSCs-Exo的治療作用與促進巨噬細胞及小膠質細胞極化有關，其可通過外源性miRNA和長鏈非編碼RNA（lncRNA）來調節巨噬細胞及小膠質細胞極化。SCI后誘發內質網應激，內質網應激主要調節因子miR-124-3p可以抑制內質網至細胞核的信號傳導［21］。SCI時M2型巨噬細胞極化標志物低表達，外源性miR-124-3p可通過MSCs-Exo轉移至巨噬細胞，并通過抑制內質網向細胞核的信號傳導來增強M2型巨噬細胞的極化，從而減輕SCI［22］。此外，攜帶miR-216a-5p的MSCs-Exo能夠激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/絲氨酸蘇氨酸激酶（AKT）信號通路，抑制Toll樣受體4（TLR4）/NF-κB信號通路，從而將M1型小膠質細胞轉化為M2型［23］。MSCs-Exo還可攜帶具有神經修復功能的lncRNA靶向細胞，lncRNAGm37494修飾的MSCs-Exo可通過抑制miR-130b-3p并促進過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達來改變小膠質細胞及巨噬細胞的M1、M2表型［24］。

5 MSCs-Exo通過抑制細胞凋亡修復SCI

SCI后繼發性的細胞凋亡可導致神經元不可逆改變，加重SCI造成的傷害，而MSCs-Exo能夠通過調節miRNA和凋亡相關蛋白減少細胞凋亡。MSCs-Exo治療后可顯著下調凋亡相關標志物Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、Caspase-9水平［25］。此外，MSCs-Exo還可以通過調節自噬相關蛋白影響細胞凋亡。GU等［26］研究顯示，MSCs-Exo增加了SCI大鼠自噬相關蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達，提示其可通過增加細胞凋亡自噬體激活細胞自噬，從而減少細胞凋亡。miR-21是SCI后顯著上調的miRNA，可下調抑癌基因PTEN、程序性細胞死亡因子4（PDCD4）和凋亡相關因子配體FasL表達，抑制神經元凋亡，對神經起到保護作用。研究顯示，MSCs-Exo轉染miR-21可抑制PTEN及PDCD4表達，減少神經元凋亡［27］。此外，miR-21-5p還具有抗凋亡作用，這種作用與促凋亡基因FasL表達水平降低有關［28］。

綜上所述，MSCs-Exo可通過促進血管生成、促進軸突生長、調節炎癥反應、調節免疫反應及抑制細胞凋亡修復SCI，其或可成為SCI修復的新希望。然而，在將MSCs-Exo用于臨床之前，MSCs-Exo的組織來源、分離、純化、擴增及聯合應用等問題亟待解決。由于MSCs-Exo單獨應用的局限性，目前許多研究將MSCs-Exo與生物材料結合，例如水凝膠或以MSCs-Exo作為載體運送基因藥物，而MSCs-Exo的聯合作用及靶向給藥機制有待進一步闡明。