注射型富血小板纖維蛋白聯合BMSCs在坐骨神經損傷的實驗研究

葉 放 王彥生 于 寧 許 蕙

沈陽醫學院附屬中心醫院手外5 科，遼寧沈陽 110000

外周神經損傷后其后續影響及功能恢復的病理生理過程十分復雜，神經組織的修復過程相對緩慢、再生生理較差[1]，而且損傷后發生局部粘連、組織萎縮和運動終板退化可能性較大，進而導致神經功能的損傷修復受到影響，是目前顯微外科重點與難點問題[2]。干細胞移植作為當今顯微外科神經修復治療的新型手段，骨髓間充質干細胞（BMSCs）是目前較為實用的種子細胞，尤其在外周神經損傷修復過程中發揮重要作用[3]。雖然其臨床應用較為廣泛，但其仍存有一定不足，如體外培養歸巢率低，移植后細胞存活能力欠佳等[4]。注射用富血小板纖維蛋白具有較高的促生長因子釋放率，從而更有效地誘導BMSCs 的生產與分化[5]。為更好地提高外周神經損傷的修復治療效果，本研究通過對大鼠應用自體注射型富血小板纖維蛋白聯合BMSCs 進行治療，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

DMEM 培養基由美國HyClone 公司提供（生產批號：20180201），十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）配膠試劑盒由上海碧云天生物科技公司提供（生產批號：201811058），CKX41型倒置相差顯微鏡由日本奧林巴斯公司提供，7000型透射電鏡由日本東芝公司提供。

1.2 研究對象

選擇10日齡SD 乳鼠6只，雌雄各半，體重為25～35 g；另外選擇2月齡SD 大鼠24只，雌雄各半，體重195～225 g；均購自沈陽醫學院實驗動物中心（合格證號：20191105）。本研究造模及入組動物選擇均通過實驗動物倫理委員會審核同意，SD 大鼠常溫下適應性飼養1 周備用。

1.3 方法

1.3.1 大鼠BMSCs 及注射型富血小板纖維蛋白的制備 取6只乳鼠采用離頸法處死，采集由DMEM 培養基從雙側脛骨干骺端沖洗骨髓，離心管反復吹打制備細胞懸液，隨后嚴格按照密度梯度離心法進行細胞分離、培養和傳代，選擇培養3 周后第4 代純化BMSCs群備用。注射型富血小板纖維蛋白以改良低速離心法進行，具體通過SD 大鼠眼眶采血法采集自體血，置于低速離心管內離心3 min后獲取漿液層與紅細胞層中間的富血小板纖維蛋白層，所制備富血小板纖維蛋白無需抗凝，但要求在制備成功后15 min 內應用。

1.3.2 分組治療 將24只2月齡SD 大鼠隨機分為觀察組與對照組，各12只，以改良擠壓損傷法制作大鼠坐骨神經損傷模型，先注射3%戊巴比妥實施腹腔麻醉，隨后雙側后肢脫毛，無菌條件下對實驗側坐骨神經止血鉗上齒擠壓45 s，將坐骨神經積壓呈扁薄狀即為模型制備成功。造模后，觀察組與損傷部位局部注射BMSCs 懸液250 μl 及自體富血小板纖維蛋白250 μl，對照組局部注射生理鹽水500 μl，治療14 d后進行相關結果分析。

1.3.3 觀察指標 比較治療前后兩組坐骨神經功能指數變化情況；分析兩組治療14 d后大鼠坐骨神經軸突透射電鏡圖像結果；統計兩組治療14 d后腓腸肌濕質量變化情況。坐骨神經功能指數為監測神經損傷后恢復情況的一種無創檢測手段，以訓練小鼠沿限定軌跡走動，并通過后爪不同顏色無毒染料印跡為標準，記錄治療前及治療14 d后兩組實驗大鼠沿軌跡行走指標，結合爪長度、腳趾展開長度等綜合計算，計算公式選擇Bain 公式進行，具體為SFI=109.5（ETSNTS）/NTS-38.3（EPL-NPL）/NPL+13.3（EIT-NIT）/NIT-8.8（N：正常足；E：傷側足；PL：足印長度；TS：足趾寬度；IT：中間足趾寬度；）,其中SFI=0 為正常，SFI=-100為完全損傷；腓腸肌濕質量指標包括：健側與實驗側腓腸肌濕質量數據，并計算腓腸肌濕質量恢復率，通過十萬分之一精度電子天平秤測定治療14 d后雙側腓腸肌濕質量，腓腸肌濕質量恢復率=實驗側（g）/正常側（g）×100%。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較使用獨立樣本t 檢驗，組內比較使用配對t 檢驗，組間率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組治療前后坐骨神經功能指數變化的比較

治療前兩組坐骨神經功能指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05），治療后兩組坐骨神經功能指數低于治療前，差異有統計學意義（P＜0.05）；且治療后觀察組坐骨神經功能指數低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組治療前后坐骨神經功能指數變化的比較（±s）

表1 兩組治療前后坐骨神經功能指數變化的比較（±s）

組別只數 治療前 治療后 t 值 P 值觀察組對照組t 值P 值12 12 85.6±13.2 85.5±13.3 0.018 0.985 5.9±0.3 29.3±1.9 42.141 0.000 20.910 14.491 0.000 0.000

2.2 兩組治療14 d后大鼠坐骨神經軸突透射電鏡圖像

兩組大鼠坐骨神經透射電鏡提示有髓鞘軸突比例情況提示，治療14 d后，大鼠坐骨神經透射電鏡提示觀察組髓鞘軸突比例高于對照組（圖1~2）。

圖1 對照組治療14 d后大鼠坐骨神經軸突透射電鏡圖（400×）

圖2 觀察組治療14 d后大鼠坐骨神經軸突透射電鏡圖（400×）

2.3 兩組治療14 d后腓腸肌濕質量變化情況的比較

治療后兩組健側腓腸肌濕質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；治療后觀察組實驗側腓腸肌濕質量高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療后觀察組腓腸肌濕質量恢復率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 兩組治療14 d后腓腸肌濕質量變化情況的比較（±s）

表2 兩組治療14 d后腓腸肌濕質量變化情況的比較（±s）

腓腸肌濕質量（g）健側 實驗側組別只數 腓腸肌濕質量恢復率（%）觀察組對照組t 值P 值12 12 0.52±0.02 0.53±0.02 1.225 0.234 0.46±0.01 0.37±0.01 22.045 0.000 88.50±0.03 69.80±0.06 965.664 0.000

3 討論

神經組織損傷后雖具有一定的組織重塑能力，但隨著微環境的改變為出現不可逆性改變[6]，進而導致神經修復與再生能力被抑制，給目前臨床上針對外周神經損傷的修復其仍屬于治療難點[7]。以往治療上多以神經電刺激等進行治療，雖具有一定效果[8]，但整體療效有待提高。近年神經支架、種子細胞及神經營養因子等生物工程手段的臨床應用，為神經組織修復帶來巨大突破[9]。

針對外周神經損傷，本研究制備大鼠坐骨神經損傷模型，其中觀察組使用自體注射型富血小板纖維蛋白聯合BMSCs 進行治療，結果顯示，治療前兩組坐骨神經功能指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；治療后觀察組坐骨神經功能指數低于同組治療前及對照組治療后，差異有統計學意義（P＜0.05）。證明針對大鼠坐骨神經損傷模型，使用自體注射型富血小板纖維蛋白聯合BMSCs 進行治療，相對于注射生理鹽水的對照組，能更好地促進坐骨神經功能指數的提高，促進坐骨神經功能的恢復。治療14 d后，大鼠坐骨神經透射電鏡提示觀察組有髓鞘軸突比例高于對照組（P＜0.05），提示自體注射型富血小板纖維蛋白聯合BMSCs在治療大鼠坐骨神經損傷方面，促進損傷神經軸突再生具有重要意義。治療14 d后，觀察組腓腸肌濕質量高于對照組，且觀察組腓腸肌濕質量恢復率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），進一步說明針對大鼠坐骨神經損傷模型，自體注射型富血小板纖維蛋白聯合BMSCs 治療對促進平滑肌細胞增殖、血管形成等具有重要價值。

BMSCs 是一種具有自我更新、多向分化和分泌功能的多能干細胞[10]，以旁分泌集落刺激因子、干細胞生長因子、內皮細胞生長因子等多種細胞因子進而調節機體炎癥反應，達到促進細胞修復，組織形成的目的[11-12]。另外，本研究使用的自體富血小板纖維蛋白聯合BMSCs在神經局部鞘內注射，更好地為神經修復提供充足營養，并在15 min 內注射，避免了凝膠狀態[13]，加大組織流動性，提高了臨床應用效果；而且通過其釋放的堿性成纖維細胞生長因子，顯著提高BMSCs增殖與分化能力，并促進神經細胞的黏附、遷移效應，提高細胞外基質蛋白水平，進而更好地誘導BMSCs 增殖與分化[14-16]，促進平滑肌細胞與血管的形成，確保神經組織血管的重塑與增殖，達到修復受損神經的目的[17-18]。

綜上所述，針對坐骨神經損傷大鼠，使用自體注射型富血小板纖維蛋白聯合BMSCs 進行治療，能有效提高坐骨神經功能，促進神經修復，提高平滑肌與血管再生能力。