全外顯子組測序對先天性泌尿系統發育異常胎兒的致病性檢出率分析

廣東省東莞市婦幼保健院（523000）羅建華 徐婉芳 袁海明

CAKUT是臨床一種常見的多樣性先天缺陷疾病，其發生與胚胎期腎臟發育缺陷存在相關性。CAKUT在活產兒中較為罕見，但在先天性結構畸形中發生率較高，約為20%～30%，部分患兒可合并其他系統異常病變，對新生兒、胎兒存活與預后造成嚴重影響。早期及時發現、診斷CAKUT發生，對改善新生兒結局等意義重大[1]。WES是一種新型現代基因診斷技術，通過對疾病相關基因進行診斷，判斷其致病性[2]。本研究，通過對2019年1月～2020年3月我院收治的100例超聲提示CAKUT病例應用WES技術檢查，分析其對致病性檢出率，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入我院2019年1月～2020年3月收治的超前超聲提示100例CAKUT病例，所有胎兒經染色體微陣列分析（CMA）未見異常；根據是否合并其他系統異常分組，A組74例單純CAKUT病例，孕婦年齡18～32歲，平均年齡（24.5±6.2）歲；B組26例CAKUT合并其他系統異常，孕婦年齡19～30歲，平均年齡（25.1±6.5）歲。兩組資料比較無明顯差異（P＞0.05）。納入標準：納入對象無腎臟異常家族史，夫妻非近親結婚，所有家屬對研究知情，同意參與。

1.2 方法 外顯子組測序：將50μL TE與1μg樣本DNA混合，將DNA采用Bioruptor超聲破碎儀片段化至200～250bp；末端補平、3'端腺苷化、接頭連接、片段選擇、擴增過程等依次采用Illumina FC-121-2033 DNA文庫構建試劑盒進行構建DNA文庫。目標區域捕獲采用Hybridization Wash Kit試劑盒、NimbleGen捕獲磁珠進行，再對目標區域采用瑞士羅氏公司高保真DNA聚合酶進行PCR擴增（濃度≥10nmol/L），PE100測序采用Hiseq 2500高通量模式進行。

1.3 Sanger測序驗證 對可能致病性、含有致病性突變位點的胎兒、父母采用Sanger測序方法進行驗證。

1.4 數據處理 突變剪切危害性預測與蛋白功能影響、注釋功能的預測根據ACMG指南進行，最后將判定所有突變位點，可分為以下幾類：良性、可能良性、不明確、可能致病性、致病性。

2 結果

2.1 分析WES檢測結果 本研究對100例超聲提示CAKUT病例進行WES檢測，結果顯示，檢測出致病性突變病例15例，涉及基因為BBS2、HNF1B、NEK8、UMOD；可能致病性突變7例，涉及基因GRIN2B、HSPD1。在CAKUT病例中，WES的陽性檢出率為22.00%（22/100）；本組22例陽性樣本中，CAKUT合并其他系統異常檢出率為57.69%（15/26），單純CAKUT病例中陽性檢出率為9.46%（7/74）。

2.2 分析兩組WES檢測結果 研究顯示，在A組74例CAKUT病例中，WES檢測陽性率為20.27%（15/74），其中3例病例顯性遺傳基因中存1個可能致病性突變，另7例含有致病性突變；WES周轉時間11～12周，WES分析顯示，26例胎兒結果可在孕周35+4～39+2周完成。

B組26例病例中，核心家系WES檢測陽性率為26.92%（7/26），其中存在可能致病性突變3例，存在致病性突變2例，未檢測出有臨床意義突變13例；WES周轉時間8～9周，本組2例得到致病性結果夫婦均選擇終止妊娠。

B組實施核心家系檢查，WES陽性率高于A組，提示核心家系檢查可提高胎兒陽性率，但兩組統計學對比，沒有統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

目前，臨床關于CAKUT致病基因方面的報道較少，有研究指出，CAKUT形成可因單個基因缺陷引起病變。臨床中，最早發現CAKUT的致病基因是HNF1B、PAX2兩個基因。近年來，隨著醫療技術的進步，基因檢測不斷有新發現。臨床產前檢查中若超聲提示CAKUT的胎兒，需要進一步檢查，詢問夫婦是否存在孕產史及家族史，判斷胎兒是否出現染色體異常。本研究顯示，對100例超聲提示CAKUT病例進行WES檢測，結果顯示，在CAKUT病例中，WES的陽性檢出率為22.00%，提示單基因變異在CAKUT發生中起到重要作用，其致病性突變基因包括：BBS2、HNF1B、NEK8、UMOD，作為已知致病基因與腎臟發育存在明顯關系。GRIN2B、HSPD1基因與MRD6/EIEE27與SPG13基因相關，包含可能致病性突變。本研究顯示，22例陽性檢出患者中，單純CAKUT病例中陽性檢出率為9.46%（7/74），合并其他系統異常檢出為57.69%（15/26），說明相比于單純CAKUT，合并其他系統異常更容易發生基因突變。對此，本研究受到研究樣本數限制，可能存在一定誤差，需要大樣本進一步作為研究支持。

本研究產前超聲提示回聲增強、雙側腎臟增大2例胎兒中，檢測出基因雜合突變，突變基因為HNF1B基因c.192-191 insGTAT突變，另3例產前超聲提示左側腦室增寬雙側腎臟回聲增強、腎臟增大的胎兒病例中，經過WES檢查顯示，基因型中存在BBS2基因復合雜合突變，突變基因為BBS2的c.1015G＞A與c.823G＞A突變。本研究顯示，這5例基因突變患兒與RCDS/腎臟回聲增強、BBS2存在相關性。但由于本研究納入對象較少，研究結果存在一定誤差，無法確定孤立性腎臟回聲增強但GMA與核型結果正常的胎兒是否需要接受WES進一步進行診斷，因為即便胎兒產前超聲顯示腎臟回聲增強，但并不能作為判定胎兒產后腎臟發育異常的特異性指標，仍有部分患兒產后并未出現異常情況[3]。對此，臨床同樣需要高度重視，產前胎兒腎臟回聲異常也是提示腎臟綜合性疾病、明顯畸形病變的重要指標，因此。臨床在超聲診斷時需輔助其他手段進一步確診[4]。

WES作為一種診斷測序的重要手段，測序的孕周選擇尤為重要。本研究對A組孕婦WES周轉時間11～12周，WES分析顯示，26例胎兒結果可在孕周35+4～39+2周完成；B組26例病例中，WES周轉時間8～9周，本組2例得到致病性結果的夫婦均選擇終止妊娠。目前，臨床中對于WES周轉時間一般為8～15周；據有關統計顯示，大部分孕婦希望周轉時間＜3周[5]。因此，在產前診斷中，WES需要加快分析與檢測速度，以提高其優越性。在對孕婦胎兒進行WES測序時，對胎兒父母外周血樣本進行收集、檢驗，有利于提高WES致病性檢出率準確性。本研究顯示，A組WES檢測陽性率為20.27%，B組核心家系WES檢測陽性率為26.92%，說明對胎兒核心家系進行分析，能夠提高胎兒的陽性檢出率。

綜上所述，產前超聲提示CAKUT胎兒通過WES測序診斷，能有效提高致病性檢出率。